巨细胞病毒mRNApp67在肾移植术后巨细胞病毒感染中的应用研究

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1、中山大学博士学位论文巨细胞病毒mRNA（pp67）在肾移植术后巨细胞病毒感染中的应用研究姓名：陈俊星申请学位级别：博士专业：泌尿外科指导教师：郑克立2003.5.25巨细胞病毒mRNA(pp67)在肾移植术后巨细胞病毒感染中的应用研究中文麓要巨细胞病毒mRNA(pp67)在肾移植术后巨细胞病毒感染中的应用研究中山大学附属第一医院泌尿外科研究生：陈俊星导师：郑克立教授摘要／人类巨细胞病毒(HumanCytomegalovirus，简称HCMV)是一种无I＼所不在的具有大干235Kb双链DNA基因组的

2、B．疱疹病毒，根据人群研究显示全世界约有60％～100％的成人感染。大多数个案通过有效的体液和细胞免疫反应调节达到满意的平衡。免疫缺乏或不正常的免疫状况可能使宿主在感染HCMV后出现严重并发症。尽管目前有效的抗病毒药物日益增多，对于胎儿、早产儿和越来越多的医源性或后天性免疫缺陷的病人，HCMV感染仍可引起严重的和威胁生命的并发症。人巨细胞毒感染是肾脏移植受者术后早期最常见和严重的感染性并发症之～，活动性HCMV感染一旦发展成HCMV病，治疗不及时死亡率极高。肾移植术后活动性HCMV感染率约为50～

3、75％，其中10～30％可发展为HCMV病；在肾移植病人，HCMV感染常导致HCMV间质性肺炎，死亡率极高，HCMV病症状和表现复杂无特异性，因此，HCMV感染的诊断主要依靠实验室检查。pp67是HCMV晚期(L)．mRNA编码的基质表层蛋白，L—mRNA是从HCMV的UL65基因中转录过来的，而该基因仅在活动感染的时候才表达，r为此牌课题就pp67的实验检测方法及其在肾移植术后HCMV活动性感／染中的诊断作用以及对指导抗病毒治疗的意义进行了研究。巨细胞病毒mRNA(pp67)在肾移植术后巨细胞病

4、毒感染中的应用研究中文奠要第一部分核酸基础序列扩增法检测人巨细胞病毒mRNA(pp67)的实验研究目的：佛官移植术后受者发生HCMV感染较为普遍，其临床症状及＼体征缺乏特算性，而且许多患者并不表现出任何症状而成为潜伏感染状态，随着患者免疫力的降低，往往突然发病，出现发热、呼吸困难等，一旦形成间质性肺炎，死亡率极高。如果在HCMV活动感染的早期及时治疗，则绝大多数患者可以得到控制而不发病，甚至可以完全清除体内病毒而治愈，而且HCMV病一旦发作，其抗病毒时间长，所需费用巨大，因此准确而早期地把握HCM

5、V在体内的活动状况，早期诊断活动性HCMV感染对临床实际有迫切的需要。近年来，随着临床上广泛预防性使用抗病毒治疗以及抗病毒药物疗效的提高，HCMV病在临床上已经得到较好的控制，但是昂贵的费用和多种的药物毒副作用仍然是许多移植中心临床面临的重要问题，为了更好地掌握开始和结束治疗的时间，需要早期证实和监测体内HCMV的活动状况，这就要求所运用的诊断方法能够直接准确地反映病毒在体内的生物学活性。目前国内一些原有的方法如病毒包涵体检查、病毒分离培养及血清抗体检测等，有的繁琐耗时，有的阳性率低，不能满足临床

6、早期、快速、敏感特异的诊断需求，人巨细胞病毒抗原血症(CMV—Ag)虽然是目前国内各大移植中心广泛运用的快速早期诊断活动性HCMV感染的最佳方法之一，但是该方法主观影响较大，假阴性和假阳性较多，结果不客观，只适合新鲜的血液标本，不适合大量临床标本的检测，临床应用也受到一定限制。RNA在体内的功能特性加上它比活性基因表达的相对丰富性，使得RNA成为监测病毒生物活性的较好选择。与DNA和蛋白的不同，由于RNA的快速合成和分解，也使它更适合作为一项直接监测抗病毒疗效的指标。过去由于功能和方法学方面的限制

7、，如RNA的不稳定性，冗长的巨细胞病毒mRNA(pp67)-在．肾移植术后巨细胞病毒感染中的应用研究中文麓要RNA分离和RT-PCR的限制性等，大大地限制了病毒RNA在HCMV活动性感染的诊断和监测上的运用。近年来，由于NASBA法的运用，它利用硅石依赖的核酸提取术，在恒温的情况下直接扩增RNA而不需要预先的DNA切割和相关DNA扩增。使分析体内多种临床标本中的RNA表达成为可能。pp67是HCMV晚期的mRNA编码的病毒基质表层蛋白，而NuclisensCMVpp67是Organon公司根据HC

8、MV的L·mRNA的相关基因序列，设计了相应的引物，将硅石提取技术进行整合并利用NASBA法进行核酸扩增的一种内部调控和标准化的mRNA试剂，通过pp67的检测反映HCMV晚期mRNA的表达情况，从而判定病毒在体内的活动性。目前众多欧美L，移植中心正在研究运用中j本研究拟在我院建立NASBA法检测CMVpp67√的实验方法和条件，并了解其在临床标本中的表达情况，以探求CMVpp67在临床应用的前景。／方法：【弋实验方法采用NASBA(Nucleicacidsequence-base