肾移植术后巨细胞病毒感染早期检测方法.doc

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肾移植术后巨细胞病毒感染早期检测方法摘要】肾移植术后巨细胞病毒(CMV)感染具有较高的发病率和病死率，早期准确的检测有利于临床治疗，本文就CMV感染的检测方法尤其是感染早期的几种诊断方法进行阐述。【关键词】肾移植；巨细胞病毒；检测方法　　巨细胞病毒(CMV)感染是肾移植术后的常见并发症，据文献报道CMV活动性感染率在肾移植术患者中约50%～75%,有10%～30%的患者为有症状的CMV感染。一旦发生严重的CMV感染,特别是间质性肺炎,病死率高达25%［1］。在移植术后,随着各种免疫抑制剂的应用,病毒将被激活。在肾移植受体中,CMV感染的临床发病率与供体和受体移植前的血清学状态以及所用免疫抑制剂的种类和剂量有关。受体CMV阳性R+/供体CMV阴性D，为继发性感染，症状较轻；如果由于供体肾及术后使用血液制品CMV阳性，即R/D+，为原发性感染,病情最为严重；若为重复感染,即R+/D+，病情较重［2］。有文献报道术前供、受体CMV血清反应均为阳性时,术后患者发生临床CMV感染的概率可达50%,供体阳性、受体阴性时术后CMV病的发生率近66%,因此而造成的CMV病、移植物丧失及医疗花费都比其他因素的大［3］。急行排斥反应和免疫抑制剂的使用是CMV感染最主要的诱发因素［4］,抗淋巴细胞球蛋白(ALG)，OKT3及细胞毒性药物能直接促使潜伏的病毒活化，而环孢素A、FK506及糖皮质激素能够抑制机体的免疫系统,导致病毒感染的播散与迁延,进一步加重病情，其中多克隆或单克隆抗淋巴细胞抗体刺激CMV感染的效应最强,成为影响移植术后CMV感染发生的重要因素。因此早期诊断和及时预防性抗病毒治疗是降低移植术后CMV病发病率和病死率的关键。CMV感染的症状常表现为不明原因的发热，伴有白细胞减少或淋巴细胞增多、血小板减少、肌肉痛、关节痛和胃纳差等，当发展为CMV病时，常引起间质性肺炎，表现为干咳和呼吸困难，严重者可发生急性呼吸衰竭。此外，还可引起脑炎、肝炎、胃肠炎、急性视网膜炎、消化道溃疡等。　　1CMV感染的检测方法　　1.1一般检查外周血白细胞减少或淋巴细胞增多，血小板减少；尿常规可发现蛋白尿，并有少量红细胞、白细胞，可有ALT和胆红素升高，肺部X线检查：双下肺炎症改变。　　1.2组织学检查病毒分离培养，取尿、血、咽拭子、支气管肺泡灌洗液及组织标本直接培养，病毒培养敏感性低，耗时常需要3周～6周时间出结果，不利于指导临床用药。组织学检查找巨形细胞,一般在严重原发性感染时更有意义。　　1.3血清学检查包括CMV抗体检查，CMV抗原血症测定法，CMV多聚酶链测定法和PP67mRNA的监测。现就血清学检查的具体方法介绍如下。6 　　1.3.1CMV抗体检查采用ELISA法测定血清中CMVIgM、IgG。抗CMV抗体血清学检查方法简单，但CMVIgM在原发性感染早期不出现，CMVIgG在继发性感染中需升高4倍才有意义。由于肾移植患者术后常规使用免疫抑制剂，CMV抗体产生常延迟或缺乏，影响阳性检出率。一般用于监测移植前供、患者的CMV携带状况。　　1.3.2CMV抗原血症测定法机体感染CMV后可在外周血白细胞中检测到CMV抗原，成为CMV抗原血症,CMV抗原血症的出现明显早于临床症状的出现和血清学的改变。CMVPP65抗原检测可以早期诊断CMV感染，已成为国际公认的监测HCMV活动性感染的“标准方法”之一［6］。CMVPP65抗原是CMVUL83基因编码的早期即刻蛋白(IEA)，在CMVDNA复制前就有合成，对CMV的复制具有调控作用,是体内早期活动性CMV病毒复制的标志［6，7］。CMV抗原血症测定法计数阳性细胞，根据已制定的参数标准来决定是否采取抗病毒治疗。通常通过免疫组织化学染色法(即标记链丝菌素生物素结合法，LSAB法)检测外周血白细胞CMV抗原，该方法可以避免用ABC法导致内源性过氧化物酶的非特异性染色而呈现假阳性的结果，而且用普通显微镜即可作出诊断。在普通光学显微镜下观察并计数5万个白细胞中CMV阳性细胞个数(称抗原指数)。阳性细胞在镜下细胞核为黄色或棕黄色，阴性细胞核为蓝色或蓝紫色。测定CMVPP65抗原敏感性及特异性均高，达90％以上，但是CMV抗原血症测定法的缺点是需要新鲜血标本(标本必须在8h内及时处理),来获得最佳敏感性，否则PP65阳性细胞数将会减少,试验的敏感性将会降低。　　1.3.3CMV多聚酶链测定法用多聚酶链反应(PCR)来扩增DNA被证实是检查临床标本CMV感染的可靠方法。通常有定性PCR技术和定量PCR技术。　　1.3.3.1定性PCR定性PCR主要检测外周血白细胞CMV的磷酸化蛋白PP71基因序列,要严格按照PCR诊断试剂盒操作说明书进行操作。根据文献报道，CMV激活性感染和潜伏性感染患者的单个核细胞中存在着低水平的CMVDNA，该方法不能区分CMV活动性感染和潜伏性感染,因此对于临床监测CMV感染有一定的局限性［8］。因而不适于CMV活动性感染的早期诊断。　　1.3.3.2定量PCR定量PCR技术避免了上述缺点，由于单个核细胞中CMV负荷量与中性粒细胞中CMV负荷量相比可以忽略不计，所以可以采用定量PCR检测外周血白细胞内的CMV负荷量，是目前较为公认的诊断CMV活动性感染的一项实验室技术、敏感性和特异性分别为100％、92％［9，10，11］，而且标本的运输，延误时间超过2d均不影响PCR分析。方法如下：抽取外周血制备白细胞，PCR法测定CMV即刻早期基因含量，以基因拷贝数(S1)/10000表示。采用自动基因扩增及检测系统，由厂家提供阳性、阴性对照，计算机自动进行质控。CMVDNA检出表明体内有CMV复制，存在着活动性CMV感染。术前对患者进行外周血白细胞CMVDNAPCR检测，阳性者且拷贝数较高，则采取抗病毒治疗，待CMVDNA下降至一定水平或转阴后再行移植手术，同时对供者外周血白细胞进行CMVDNA检测及做出相应处理。据报道，病毒含量超过1000拷贝/10000都发展成为有症状的CMV病，以1000拷贝/1006 000白细胞为预测CMV病症状发作的阈值,其敏感性为35%,特异性为100%。如果超过该阈值即需要抗病毒治疗。在治疗的过程中，反复检测外周血白细胞CMVDNA(通常术后3个月1次/周，术后3个月～6个月每两周一次)，随着抗病毒药物的应用，CMVDNA的拷贝数会下降。当CMVDNA水平缓慢下降或不下降,体内CMV的半减期延长时,可能是CMV对抗病毒药物如更昔洛韦耐药性的一个早期提示［12］。由此可见，定量PCR技术在决定受体进行移植手术的最佳时间、供体的选择以及预测肾移植受者CMV感染的症状发作和监测抗病毒药物的疗效等方面有着极其重要的价值。目前有一种新的PCR技术称为RealtimePCR动态监测技术，所谓RealtimePCR是指热循环仪在每个PCR循环过程中，通过检测反应管内荧光信号的变化来推导反应体系中待测物的起始模板数，不仅能够测定病毒负荷,还能监测病毒负荷的动态,反映病毒复制水平［13，14］,并根据病毒的拷贝数来调整免疫抑制方案，从而通过调整机体的免疫状态来预防CMV病［15］。郑克立等提到决定肾移植术后CMV感染状态的主要因素是机体本身的免疫力，术后合理使用免疫抑制剂避免过度抑制尤其重要，术后机体虽然处于免疫抑制状态，但对体内持续存在的病毒如CMV仍具有相应的应答，当这种平衡被破坏，就可能发生CMV病［16，17］。据临床报道肾移植术后使用骁悉后CMV病发生率有所上升，是因为骁悉的强烈免疫抑制作用破坏了免疫平衡点造成免疫失衡。采用RealtimePCR动态监测体内CMVDNA的拷贝数，根据病毒复制情况及时调整免疫抑制方案，完全可以预防CMV病的发生。RealtimePCR动态监测患者术后白细胞内CMVDNA的拷贝数，参考ROBERT实验，选择以800拷贝/100000白细胞为预测CMV病的阈值,对拷贝数超过800拷贝/100000白细胞者,予调整免疫抑制方案,减少环孢素的用量,以提高机体的自身免疫力,白细胞内的CMVDNA可逐步降至安全范围。本法比PP65抗原血症测定有更高的敏感性,而费用更低,操作更简单［18］。　　1.3.4PP67mRNA的监测使用核酸系列扩增技术(NASBA)检测CMV后期基因表达(PP67)是一种快速、敏感性和特异性都很高的诊断方法。研究发现CMV是一种多嗜性病毒，它在体内的基因表达有些受到限制，也就是有即刻早期(IE)基因和早期(E)基因表达，而没有晚期(L)基因表达，即所谓病毒流产型感染，而在其他一些细胞里，IE、E和L基因全部表达，形成转录型感染，导致病毒的复制、传播和后继疾病的发展，而这种所谓转录型病毒感染的重要标志就LmRNA的出现。PP67是LmRNA编码的CMV基质表层蛋白,它检测真正的晚期LmRNA,真正反映活动性的CMV感染,对PP67的监测可以准确地反映出体内CMV的活动状态。PP65是属于早期的CMV抗原，它的出现反映了病毒在宿主中的早期感染阶段，但在临床实践中常发现PP65阳性细胞可以出现在未成熟的、流产型感染中，患者阳性抗原血症并不一定发展成全身CMV感染。因此,如果早期治疗是建立在即刻早期抗原或早期抗原指标的基础上,那么有一部分患者其实是不需要接受抗病毒治疗的,而晚期抗原如PP67与活动性症状性感染严密相关,采用晚期抗原如PP67作指标,则可以使这一部分比例得以减少。PP67检测可早于PP65抗原血症测定发现CMV感染,其敏感性也高于后者,且能及时发现停药后感染复发的病例,对诊断CMV病很有用［19，20］。　　2结语　　CMV是疱疹病毒科B属的DNA病毒,正常人群中感染普遍,6 但多为隐性感染或症状轻微，有资料显示CMV感染者占发达国家人口的30%～70%,占发展中国家人口的90%～100%［2］。由于肾移植术后,随着免疫抑制剂的应用,潜伏的CMV都将被激活。血清CMV抗体检测CMVIgM在原发性感染早期不出现，CMVIgG滴度需升高4倍才有意义，一般用于监测移植前供、患者的CMV携带状况，而不用于CMV感染的早期诊断。CMV抗原血症检测技术对于CMV活动性感染的诊断具有高度的灵敏性和特异性，同时对CMV病的发生还具有重要的预测意义，是一种经济可行的诊断方法。定性PCR容易出现假阳性结果，而且不能区分CMV活动性感染和潜伏性感染,因而不适于CMV活动性感染的早期诊断。定量PCR是目前较为公认的诊断CMV活动性感染的一项实验室技术,同样具有高度的灵敏性和特异性，PP67mRNA的监测是一项新的技术，该法实用、客观，可以准确反映CMV的活动状态，值得推广应用。总之，CMV抗原血症测定法和定量PCR技术是目前诊断CMV活动性感染应用较广的两种检测技术，有研究表明两种方法检测结果具有良好的一致性(92％)，其中阳性符合率67％，阴性符合率92％［9］。两种方法的联合应用对监测CMV活动性感染、临床疗效及预后更加客观、准确。【参考文献】　　［1］陈劲松,唐政.肾移植后肺部巨细胞病毒感染［J］.肾脏病与透析肾移植杂志,2003,12(4):397400.　　［2］SchnitzlerMA,WoodwardRS,BrennanDC,etal.Theeffectsofcytomegalovirusserologyongraftandrecipientsurvivalincadavericrenaltransplantation:implicationsfororganalloction［J］.AmJKidneyDis,1997,29(3):428434.　　［3］SchnitzlerMA,LowellJA,HardingerKL,etal.TheassociationofcytomegalovirusseropairingwithoutcomesandcostsfollowingcadavericrenaltrausplantationpriortotheintroductionoforalganciclovirCMVprophylaxis［J］.AmJTransplant,2003,3(4):445451.　　［4］AbbottKC,HypoliteIO,ViolaR,etal.HospitalizationsforcytomegalovirusdiseaseafterrenaltransplantationintheUnitedStates［J］.AnnEpidemiol,2002,12(6):402409.　　［5］李敏,季育华.监测HCMV活动性感染的一种新方法—HCMVPP65抗原血症检测［J］.中国免疫学杂志,2002,18(6):439441.　　［6］EganJJ,BarberL,LomaxJ,etal.Detectionofhumancytomegalovirusantigenaemia:arapiddiagnostictechniqueforpredictingcytomegalovirusinfection/pneumonitisinlungandhearttranspiantrecipients［J］.Thorax,1995,50(1):913.　　［7］MeyeKonigU,SerrA,etal.Humancytomegalovirusimmediateearlyandlatetranscriptsinperipheralbloodleukocytes:diagnosticvalueinrenaltransplantrecipients［J］.JInfectDis,1995,171(3):705709　　［8］6 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