HEK293细胞内源性电压门控钾通道电生理学特性研究

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1、首都医科大学硕士学位论文__中文摘要背景与目的:人胚胎肾细胞(Humanembryonickidneycells,HEK293细胞)是研究离子通道的一种重要的表达系统，已经广泛应用于离子通道的研究。但关于HEK293细胞的内源性离子通道的种类及电生理特性的研究结果尚有争议。为避免HEK293细胞上内源性离子通道对外源性离子通道表达时的干扰，有必要对其内源性离子通道进行研究。本研究利用全细胞膜片钳技术分析了HEK293细胞内源性电压门控钾通道的电生理特性。方法:1细胞培养:HEK293细胞在370C5%CO:的孵箱中孵育，培养液为含

2、10%小牛血清的DMEM。每周传代两次，以5X104/ml细胞密度接种于35mm培养皿中，24小时后进行膜片钳实验。2膜片钳实验:控制室温在22250C，通过倒置显微镜选择直径20-3如m,胞膜完整，胞体丰满的细胞记录。电极由硼化硅酸盐玻璃毛细管用SutterP-97拉制仪分两步拉制完成。入水阻抗2-10MO。运用膜片钳技术，在全细胞模式下分别记录不同K+浓度的细胞外液时外向钾电流的变化，以及加入四乙胺(tetraethylammonium,TEA).4-氨基毗吮(4-aminopyridine,4-AP)后外向钾电流的变化。使用

3、数据记录/分析系统PULSE/PULSEFIT(HEKAElectronik，德国)软件将电流和电压显示和储存在计算机上。首都医科大学硕士学位论客一结果:在HEK293细胞上去极化电压从一80mv开始可触发一个外向电流。在+100mv时电流为422.78士68.87pA，电流密度为21.91士3.20PA/PF。钾通道阻断剂TEA使该外向电流在+100mv从409.49士200.59pA下降到223.05士102.OOpA，抑制的百分比为44%120%(n=7)，使电流密度从20.13士11.52pA/pF降至12.06士6.60

4、pA/pF，抑制的百分比为39%士22%.4-”在+100mv可使电流从467.53士143.77pA下降到324.14土87.60pA，抑制的百分比为30%士6%(n=6)，电流密度从22.56士5.96pA/pF降至16.83士3.22pA/pF，抑制的百分比为24%士10%。将细胞外液钾浓度由4mM提高到40mM，在+100mv时，外向电流由422.78士68.87PA减小至333.79士23.45PA，提高到120mM，外向电流减小至192.34士40.78PAo结论:正常培养的HEK293细胞本身有内源性的钾通道。这个钾

5、通道维持一个较大的外向电流，很多方面与延迟整流钾电流(l')类似。钾通道阻断剂TEA和4-AP的实验证明这个外向电流可能包括了Ik,LIPIkw和it.。当HEK293细胞作为离子通道的表达系统研究与之相似的离子通道时，要注意区别这些细胞的内源性离子通道。关键词:HEK293细胞，膜片钳，全细胞记录，延迟整流，电压门控钾电流。首都医科大学硕士学位论文StudyingElectrophysiologicalPropertiesofEndogenousVoltage-GatedPotassiumChannelsinHumanEmbry

6、onicKindey似EK293)CellsABSTRACTBACKGROUDANDOBJECTIVE:Humanembryonickidney(HEK293)cellsarewidelyusedasanexpressionsysteminstudiesofionchannels.Tostudythepropertiesofexogenousionchannelsexpressedinthesecells,itisimportanttoevaluateendogenouschannels.However,Theresultsofe

7、ndogenousioniccurrentsstudyfromdiferentresearchcentersareconflict.Tocharacterizethesecurrents,weperformedpatchclampexperimentsonthisexpressionsystem.Endogenousvoltage-gatedoutwardcurrentswereinvestigatedinHEK293cells.METHODS:Lcellculture:HEK293cellswereculturedinDMEMm

8、ediumwith10%fetalbovineserumandpenicillin/streptomycinadded,andincubatedat370Cwith5%C02inatmosphere.Thecellswereculturedin35