水解乳清蛋白的连续循环切向流酶膜反应器的优化及稳定性研究

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1、江南大学博士学位论文水解乳清蛋白的连续循环切向流酶膜反应器的优化及稳定性研究姓名：SeroneiCheluleiCheison申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：王璋20061201SouthernYangtzeUnivers妙首先在1L批式反应器中对水解乳清分离蛋白(WPI)的酶进行了筛选。分别以2％(v／v)的WPI乳清分离蛋白和2％(v／v)的酪蛋白为底物，测定并比较了Alcalase2．4L(Ec3．4．21．62)、Flavourzyme(EC3．4．11．1)、ProteaseA(EC3．4．24．39)及ProteaseN(IUB3．4．24．28)4种酶的酶活

2、，并测定了反应结束后的残余酶活、水解产物的相对分子质量分布以及游离氨基酸含量。结果表明：ProteaseN和Alcalase2．4L分别对WPI和酪蛋白的水解活性最高。水解WPI时，Alcalase2．4L，ProteaseN和ProteaseA都能产生短肽，但Alcalase2．4L不易被底物抑制，ProteaseN易被水解产物抑制，而ProteaseA则释放出大量的游离氨基酸。Flavourzyme对WPI的水解能力最弱，水解释放的游离氨基酸也最多。在用反相高压液相色谱(RP--HPLC)分析游离氨基酸之前，采用5％三氯乙酸(TCA)和3．5％磺基水杨酸(SSA)能沉淀除去Fl

3、avourzyme和ProteaseA水解产物中的短肽，而对Alcalase2．4L和ProteaseN酶解产物中短肽的去除效果并不明显。水解WPI的各种酶按活性排列依次为Flavourzyme

4、跟踪分析比较少。目前的方法存在耗时长、操作麻烦的缺点，因此需建立一种快速、可行且重复性好的方法。本文研究并建立了一种简便可靠的方法来监控酶膜反应过程中酶的变化。酶的变化可以表示为残余酶活(A。Ⅺ。d，酶的渗漏('AJeabge)及酶的损失(AI啷)之间的一种平衡，对实验结果的分析仅需1h。采用响应面(RSM)中心点旋转设计方法考察和优化了酶膜反应器中水解WPI的操作参数，并通过主成分分析法(PCA)对实验结果进行了多元数据分析。WPI的酶解条件为：在10kDa或3kDa的切向流(TFF)酶膜反应器中，采用ProteaseN对初始浓度为5％(w／v)的WPI在55"C，pH7．0条件

5、下连续水解5h。响应面实验选取的三个因素及其水平分别为：进料温度(A：25-55"C)，初始膜透水量山(B：1．6-18．4mUm呐)和加酶量(C：0．5-5内)。响应变量分别为：残余酶活(A删)，酶的渗漏(Al。k卵)，酶的损失(A岫)，平均膜通量摘要(Jmme)以及透过液中的蛋白质回收率(S。；)parent)。由于酶解时采用的ProteaseN最适作用温度为55℃，因此当进料温度低于55。C时，在膜的入口和出口处分别加装了能冷却和再加热的温控装置。实验结果表明：进料温度低至25．30。C时，J删大幅下降，50"C时高活性的酶能水解溶化膜表面的动态凝胶层，使得JM样得到稳定，同

6、时S狮aⅢ和Ahl【a口e增加，而Ar喇吲下降。Javerage和Sapparmt随着进料温度、Ji和酶浓度的增加而升高。ProleaseN酶活损失的主要原因有：低膜通量时的产物抑制作用，低酶浓度时的底物抑制作用，以及高膜通量和高进料温度时酶的渗漏加剧。酶膜反应时高的循环速率还能防止底物沉积于膜上，从而有助于维持较高的J。。。由响应面分析并优化后得到的最佳工艺条件是：WPI浓度，约5％：Ji，约15mL／min；进料温度，50"C；加酶量：约3．0g／t000mL。在此优化条件下进行验证实验，结果与模型预测值十分吻合。在最佳条件下，单独使用10kDa或3kDa的一步酶膜反应，蛋白质

7、回收率分别为68．48％和45．24％，J。悖噶目。分别为79．41％和40m％，而Am“}分别为“．63％和48．“％。将经过tOkDa反应的水解液再通过3kDa的两步酶膜反应中，第二阶段(3kDa)回收的蛋白质占第一阶段(10kDa)回收蛋白质的52．86％．占原料总蛋白质的21．62％。第二阶段的JM姐。和A。蝴删分别为78．26％和54．50％。单独使用10kDa和3kDa的一步反应的A吲dIJal分别为48．44％，34．63％，主成分分析显示：PCI和PC