芽孢杆菌PY1的菌种鉴定及其抗真菌产物的分离纯化、性质研究和结构鉴定

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1、四川大学博士学位论文芽孢杆菌PY-1的菌种鉴定及其抗真菌产物的分离纯化、性质研究和结构鉴定姓名：龚萌申请学位级别：博士专业：遗传学指导教师：程惊秋20060331四川大学博士学位论文断大小并加以回收；将16SrDNA片段连接入测序质粒载体，转化大肠杆菌后，通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行测序；将测得的序列提交到16SrRNA序列分析网站进行比对，鉴定PY一1菌的分类，并查找同源性最高的菌株，建立它们之间的系统进化树。最终两种鉴定结果一致判定PY—l菌是一株枯草芽孢杆菌。对APS的纯化，采用了分两步进行的方案：(1)使用酸沉

2、淀、甲醇抽提、分子筛层析的方法制得APS的初提品(后来由温江发酵工业研究所对该法进行进一步优化)；(2)使用反相高效液相色谱，对APS实施精细纯化，得到了五个活性组分(命名APSI一5)。本研究中使用了SephasilPeptideC8、S叫RCE15RPC和SoURCE5RPC三种的反相层析柱对APS的纯化条件进行摸索，并用CosmosilC18分析柱分析分离产物的纯度；在比较分析了三种层析柱应用于APS分离的优缺点后，最终确定使用SOURCE5RPC反相层析柱纯化制备大量APS。纯化后的APS对双缩脲反应呈阳性以及酸解

3、后对茚三酮的显色反应，确认了其本身氨基酸、肽键结构的存在；但天然状态APS对茚三酮的阴性反应，提示着APS有不同于普通多肽的特殊结构。稳定性测试表明APS具有很高的稳定性，它对酸、碱、高温和变性剂都有很强的耐受性。使用紫外光谱和荧光光谱对APS进行了分析：APS在275nm处有特征紫外吸收峰；用277nm激发光可以使APS产生最强荧光；APS在281nm激发光下发射荧光在307nm处出现最大值，而在295nm的激发光下基本不产生荧光：这些结果表明APS有酪氨酸残基，而无色氨酸残基，并且酪氨酸残基位于分子表面直接暴露在水相中

4、。APS具有广谱的高效抗真菌作用，对多种动植物真菌病原体以及酵母都有优于氟康唑的抑制作用，而且APS卜5具有活性增强的趋势。以氨基酸组成分析为参考，主要应用质谱和核磁共振技术对APS的n四川I大学博t学位论文化学结构进行了解析：使用电喷雾时间飞行质谱测定了APS的分子量，从APSI一5分别为1042，1056，1056，1072，1072，猜测五种APS为同系物。选取APSI和APS4进行氨基酸组成分析，结果表明它们的氨基酸组成一样，即含Asx、Glx、Pro、Ser和Tyr，比例为3：1：l：1：1，推测五种APS都是相

5、同的氨基酸组成。用高分辨率质谱结果计算出APSI的合理分子式。结合氨基酸组成，使用快原子碰撞诱导碎裂串联质谱(FAB—MS：／MSCID)识别APS中的氨基酸残基，从谱图中分析出两套离子碎片，以此判定APS为一类环肽，并推导出APS的氨基酸序列；由1H-1HCOSY、1H-'HTOCSY、‘H-'HNOESY三种核磁共振谱再次识别APS的氮基酸残基并推导序列，并与质谱结果相互映证，最终确认APS的氨基酸序列为cyclo-Tyr-Asn—Gln—Pro—Asn—Ser—BAA-Asn。五种APS氨基酸序列相同，其差别在于B氨

6、基酸(BAA)的碳链长度和构型，B氨基酸的结构由一维碳谱、DEPT谱和HSQc谱共同识别。关键词：芽孢杆菌PY_l；抗真菌多肽APS；菌种鉴定；分离纯化；理化和生物学性质；结构鉴定。IllldentificationofBaci，lusPY一1StralnandPurification。CharacterStudyandStructuraIAnalysisofItsAntifungaIProductAbstractAtpresent，utilizationofantibioticdrugswasthemainmethodt

7、ocurebacterialinfection，butthereisshortofeffectivedrugsagainstfungalinfectionyet．Aseukaryote，fungihavethesimilarcellstructureandenzymecatalysissystemasplantandanimal，sotheantibioticsagainstbacteriacannotaffectfungiandantifungaldrugsoftenhavestrongtoxicitytothecell

8、sofplantandanimal．Fungalpathogensoftenattackthepatientswhoseimmunesystemwasruined，suchastheAIDSpatlents，terminalcancerpatients(especiallyafterradiothera