土壤芽孢杆菌分离及其酶活力鉴定

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1、广州大学综合设计性实验报告土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院：生命科学学院专业：生物技术专业课程：微生物学实验生技131班卢婉华1314300076时间：2013年11月24日土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定一、实验目的1、了解微生物分离提纯的原理和技术方法。2、掌握从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌的原理和技术方法。3、掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力坚定的原理和技术方法。4、对所学过的微生物实验方法进行综合技能训练。5、培养学生自行涉及试验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的综合应用微生物实验方法的能力。6、从不同环境土壤样品中筛

2、选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。二、实验原理1、土壤中富含微生物，我们可以从土壤中获取我们所需要的能产淀粉酶的芽孢杆菌。离地表10cm~30cm的土层中菌数最多。2、从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。3、芽孢杆菌能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以折光性强、对染料不易着色，芽孢对热、干燥、辐射、化学消毒剂和其他理化因素有较强的抵抗力。绝大多数是一个

3、菌体仅形成一个芽孢芽孢位于菌体内，为革兰氏阳性菌。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。繁殖快速（代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍，标准菌四小时仅可繁殖6倍。）生命力强（无湿状态可耐低温－60℃、耐高温+280℃，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厌氧繁殖）。）体积大（体积比一般病源菌分子大四倍数，占据空间优势，抑制有害菌的生长繁殖。）4、平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细

4、胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。5、高温（100℃）灭杂菌放线菌：大多数放线菌的最适生长温度为23-37℃，高温放线菌的生长温度范围在50-65℃，霉菌：对于大多数霉菌，加热至80℃，持续20分钟即可杀灭酵母菌：在低于水的冰点或者高于47℃的温度下，酵母细胞一般不能生长，最适生长温度一般在20℃~30℃。酵母菌能在pH值为3.0-7.5的范围内生长，最适pH值为pH4.5-5.0。6、淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物

5、的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。7、借助于伯杰氏细菌学手册，我们可以通过生理生化实验结果判断出该芽孢杆菌的种的名称，从而达到鉴定的效果。三、试剂材料和器材牛肉膏蛋白胨：水1000ml营养琼脂33gNaCl0.5gpH7.2—7.4淀粉牛肉膏蛋白胨：水500ml营养琼脂16.5g淀粉1gpH7.2—7.4葡萄糖蛋白胨培养基(V.P和MR.试验)：葡萄糖0.5g蛋白胨0.5gNaCl0.5g蒸馏水100ml(pH7.2~7.4)121摄氏度灭菌20min蛋白胨水（吲哚）：蛋

6、白胨1gNaCl0.5g水100mlPH7.2—7.4121摄氏度灭菌20min西蒙氏柠檬酸盐培养基（柠檬酸盐试验用）：柠檬酸钠0.2gNaCl0.5gMgSO4·7H2O0.02gK2HPO4·3H2O0.1g(NH4)2HPO40.1g1%溴麝香草酚蓝1ml琼脂1.5—2g水100ml耐盐培养基:蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠2g琼脂1.5～2.0g蒸馏水100ml蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠5g琼脂1.5～2.0g蒸馏水100ml蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠7g琼脂1.5～2.0g蒸馏水100ml蛋白胨1g牛肉膏0.3g氯化钠10g琼脂1.5～2.0g蒸馏水1

7、00ml糖酵解培养基(葡萄糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖):蛋白胨0.2g氯化钠0.5gK2HPO40.02g1.0%溴甲酚紫0.2ml糖1.0g(pH7.0~7.2)酪氨酸水解培养基:5%2-酪氨酸10mL营养琼脂100mL.用时再混匀.硝酸盐培养基:KNO30.02g蛋白胨0.5g水100mLpH7.4酪素平板（酪素水解用）：脱脂奶粉5g+水50ml琼脂1.5g+水50ml将两液分开灭菌，待冷却至45—50摄氏度时，将两液混合倒平板，即成牛奶平板明胶培养基：蛋白胨0.5g牛肉膏0.3g明胶12g水100ml(pH6.8~7.0)运动性穿刺