(生物学)转基因动物与动物生物反应器

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1、第九章转基因动物与动物生物反应器转基因动物转基因动物培育技术转基因动物的应用动物乳腺生物反应器转基因动物转基因超级鼠1982年，英国的《自然》杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中，培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快2～3倍，体积大一倍。转基因动物（transgenicanimal）的概念指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后，随细胞的分裂而扩增，在体内表达，并

2、能稳定的遗传给后代的动物。即指基因组中整合有外源基因的一类动物。整入动物基因组的外源基因被称为转基因(transgene)。转基因技术克服了物种之间的生殖隔离，实现了动物物种之间遗传物质的交换和重组。建立转基因动物时，外源基因可能只整合入动物的部分组织细胞的基因组，也可能整合进动物所有组织细胞的基因组中。我们把只有部分组织的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物(mosaicanimals)。嵌合体动物只有当外源基因整合进去的"部分组织细胞"恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代

3、；否则，外源基因将不能传给子代。动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。当外源基因在转基因动物体内表达，并培育出其表型与人类疾病症状相似的动物模型，则称其为转基因动物模型。Gordon等首次成功地将含有HSV和SV40DNA片段的重组质粒DNA以显微注射法导入小鼠受精卵的雄原核内，得到了带有这种外源DNA顺序小鼠。1

4、982年，Palmiter等运用此法得到的所谓“超级巨鼠”,曾引起整个生物学界的轰动。到目前为止，人类已获得转基因鱼、鼠、羊、猪、兔、牛等等大小动物。从转基因动物所获得的资料几乎涉及医学遗传、肿瘤学、免疫学等的基因研究，还涉及生物药物的研究，基因治疗的开发研究等。目前建立转基因动物的主要策略有两种：一种是让转基因在动物体内过度表达的方法。最常用的是显微注射方法。转基因可用基因本身的启动子，也可拼接组织特异性表达的外源启动子；可转入单基因，也可转入双基因。另一种方法是让基因在体内灭活，丧失其功能，

5、即基因敲除技术。这就是近年来发展的用胚胎干细胞进行基因打靶技术，以产生基因缺陷的转基因动物。转基因动物的制作方法1、受精卵雄原核显微注射法2、胚胎干细胞（ES细胞）法3、逆转录病毒感染法4、体细胞核移植法5、精子载体法1、雄原核显微注射法以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的雄原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。目前应用较广泛，最早最经典的方法。ExpressionofExogenousGenes这一方法的实验程序如下：

6、（1）目的基因的制备与纯化通过酶切方法获取DNA，以质粒作为载体，转化到E.coli扩增质粒，分离纯化重组质粒DNA，酶切为线状基因片段。（2）准备卵供体母鼠和假孕母鼠（养母）超排卵处理供体母鼠，与正常雄鼠结合；假孕母鼠与结扎雄鼠结合。（3）基因导入（基因显微注射法）在显微操作仪上，用注射针将纯化后的目的基因注射到受精卵的雄原核内（4）胚胎移植受精卵发育到桑椹胚或囊胚期时，移植到假孕母鼠的子宫内。（5）对幼鼠的鉴定取出生幼鼠DNA，用PCR、Southernblot等在基因水平检测目的基因，用N

7、orthernblot和Westernblot等方法在转录、蛋白质水平上检测目的基因的表达。获得阳性鼠（首建鼠）。（6）建系将首建鼠与同品系正常鼠交配，当F1代阳性率为50％，选择性状好的转基因小鼠进行近亲繁殖，再从子代中，选择纯合子个体进行交配，建立转基因小鼠近交系。实验流程图优点：外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；方法简单，导入过程直观；整合率较高：30％缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性2逆转录病毒感染

8、法逆转录病毒(retrovirus)作为转基因载体是目前应用较成功的一种基因转移方法。主要是利用逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性的特点，将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后，再包装成为高浓度病毒颗粒，去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中。携带外源基因的逆转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的高度整合特性，可大大提高基因转移的效率。缺点：转入的外源基因的大小受到限制,一般在10kb以下。获得纯合体的转基因动物的机会少。病毒