第九章转基因动物与生物反应器

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1、第9章转基因动物与生物反应器9.1转基因动物的培育技术9.2转基因动物的应用9.3动物乳腺生物反应器将特定的目的基因从某一生物体分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定整合有人工导入外源基因的动物称为转基因动物（transgeneticanimal）。引言1.转基因牛①从屠宰场杀掉的奶牛体内收集卵母细胞，并使之在体外成熟⑦用公牛精液对成熟卵母细胞进行体外受精；②受精卵离心，浓缩卵黄；④将欲导入的DNA微注射到桔前核当中；⑤对胚胎进行体外培养；⑥利用非外科移植术将一个胚胎植入发情的代

2、孕母牛子宫内；⑦对于代进行州A检测，确定是否存在转人基因。转基因动物研究现状2.转基因绵羊、山羊和猪在山羊奶中生产ATT3.转基因禽类4.转基因鱼将克隆的外源基因注射到一个受精卵的细胞核中；接种后的受精卵移植到雌性受体的子宫，使其顺利完成胚胎发育；移植后的受精卵发育生长为后代，其中的部分后代其细胞中都携带有转入的外源基因；利用这些能产生外源蛋白的动物作为种畜或种禽，培育新的纯合系。外源目的基因的制备外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞选择获得携有目的基因的细胞选择合适的体外培养系统和宿主动物转基因细胞胚胎发育及鉴定筛选所得的转基因动物品系转基因动物技术路线9.1目的基因的制备9.1.1目的

3、基因的来源9.1.2目的基因的克隆9.1.3目的基因的转移9.1.1目的基因的来源采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；通过mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。9.1.2目的基因的克隆通过载体在适当的宿主中克隆选择载体目的基因与载体的连接重组体导入受体细胞通过PCR反应克隆目的基因9.1.3目的基因的转移电穿孔法显微注射法裸露DNA直接注射磷酸钙—DNA共沉淀法脂质载体包埋法病毒介导的生物学方法电穿孔法实现外源基因的转移利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。显微注射

4、转基因技术利用显微操作技术转移外源基因的方法。此法转入基因长度可达数百kb；并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。脂质载体包埋法将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞

5、膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。这种方法转基因效率高。病毒介导的生物学方法9.2转基因动物的培育技术基因显微注射法胚胎干细胞移植法反转录病毒法精子载体导入法YAC介导的基因转移细胞核移植技术何为显微注射？显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。9.2.1基因显微注射法通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵

6、为35个；与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵；将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内；将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；从小鼠子代体内取出DNA样品进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点；子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达。DNA显微注射法的基本程序通过DNA显微注射获得转基因小鼠示意图1.显微注射DNA的制备与纯化DNA构型和末端结构载体DNA的长度与浓度溶解DNA的缓冲液DNA的纯度2.鼠的准备与要求转基因鼠实验所用各类鼠3.超排卵与取卵孕马血清（PMS）其有效成分为卵泡刺激素（

7、FSH）。人绒毛膜促性腺激素（hGG）雌鼠的排卵时间：PM10.00~12.00雄鼠的排精时间：PM10.00~12.00受精一般发生在：AM1.00超排卵制定排卵程序：(1)于第一日中午先向小鼠腹腔内注入5一l0单位的PMS；(2)过48小时(第三天中午)腹腔内注入5—10单位的人hCG(注射后11—13小时后排卵)；(3)令雌雄动物一对一的合笼交配；动物半夜交尾，如未发生交配，两周后可再重用，