转基因动物原理与技术方法

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1、KKME---专业医学搜索引擎http://www.kkme.net/转基因动物原理与技术方法(一)动物转基因原理动物转基因实际上是通过特定人工操作技术把外源基因导入动物的性细胞系，它是多学科理论和技术的综合运用。1.转基因的细胞学原理：(1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosispromoti

2、ngfactor，MPF)调控，MPF在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。(2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡKKME---专业医学搜索引擎http://www.kkme.net/期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(

3、NEBD)和早熟染色体凝集(prematurechromosomecondensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的特点。2

4、.转基因的胚胎学原理：(1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通过雌雄原核

5、的融合把外源基因整合入受精卵。有的研究者认为，注射时间应选在精卵融合后的受精卵有丝分裂S期进行，外源基因可以借助受精卵自身基因组DNA复制时形成的缺口或缝隙及重组过程，整合到受精卵的基因组中。KKME---专业医学搜索引擎http://www.kkme.net/(2)禽类转基因的胚胎学原理：家禽与哺乳动物相比其生殖生理特点有所不同，家禽卵子在输卵管中遇到精子完成受精，可能有多个精子进入卵细胞，精子进入时，卵子处于第二次分裂中期。精子入卵后，卵子排出第二极体，此时二者分别形成雄原核、雌原核，然后雌雄原核融合，雄原核很快被包上一层脂粒。融合后的受精卵在输卵管前移的过程中一边分裂，一边形成卵清

6、、蛋壳等，鸡蛋产出体外时，已发育到6000个细胞的囊胚期。由于单细胞期的卵子不易获得，因此不宜对卵子进行基因操作。鸡卵子受精时有多个精子进入卵细胞，无法辨清哪一个精子与雌原核融合，且雄原核很快包上一层脂粒，所以也无法像哺乳动物那样对雄原核注射。所以鸡的转基因操作，一般选择在刚产出蛋(即未孵蛋)的胚盘进行注射，注射位置是受精卵胚盘中央质膜下方30μm处的囊胚腔，靠近雌原核。KKME---专业医学搜索引擎http://www.kkme.net/(3)鱼类转基因的胚胎学原理：Ozato等(1986)曾将外源基因注射到V期卵母细胞核中，使这种注射了外源基因的卵母细胞在体外成熟、受精，然后获得转基

7、因鱼，但卵母细胞能够在体外条件下完全成熟的鱼类只有三种即金鱼、斑马鱼、青锵，所以这种方法受到限制。对于其他的鱼类，通用的方法是把外源基因注入细胞质。鱼卵子外被卵壳，存在受精孔，精子自受精孔进入卵子，受精后，受精卵的核看不清楚。但鱼卵是端黄卵，受精后，位于植物极端的细胞质向动物极方向集中而形成卵内细胞质流。这种细胞质流有助于导入的外源基因与受精卵原核DNA的接触。所以转基因鱼的制作是把外源基因注射到受精卵的卵原核附近的细胞质内，注射在