转基因动物与生物反应器

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1、第十章转基因动物与生物反应器10.1转基因技术基因工程技术：按照人们的意愿，重组DNA（一种生物DNA中的遗传密码片段连接到另一种生物的DNA链上），设计新的遗传物质，创造新的物种。转基因技术：通过人工操作的方法将外源基因整合到生物体基因组内，使该转基因生物能稳定地表达并将此基因遗传给后代的实验技术。10.1.1细胞转染外源基因的方法常用的哺乳动物细胞转染（接受外源基因）的方法有两种：1. 暂时转染：质粒在宿主细胞内不必停留很长时间，DNA转录成mRNA，翻译成蛋白质，并不进入基因组。如磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体载体发等。2. 永久性转染：逆转录病毒载体法可产生永久

2、有效的转染。10.1.1细胞转染外源基因的方法基因转移的方法：物理、化学和生物方法。一、物理方法1.电穿孔法：利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米级的微孔。从而使外源DNA不经过胞饮作用直接转移至细胞中。2.微注射法：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄鼠交配，处死雌鼠取出受精卵。借助显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄核内，将受精卵移植到另外一只假受孕的母鼠的输卵管内，正常发育、繁殖出转基因鼠。10.1.1细胞转染外源基因的方法3.裸露DNA直接注射法将裸露DNA直接注射到组织中，DNA有可能直接被细胞所摄入。最简单，但效率低。二、化学方法生1、DEAE-葡聚

3、糖法将外源DNA片段与DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合物混合，这样DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE的正电荷基团上。2.磷酸钙-DNA共沉淀法：磷酸缓冲液（pH7.1）溶解DNA，加氯化钙，磷酸钙与DNA共沉淀形成大颗粒。通过钙、磷诱导细胞吞噬或脂相收缩的空隙，DNA进入细胞。3.脂质体载体包埋法：人工膜泡（载体）包裹DNA，与受体细胞融合。10.1.2转染细胞的鉴定可设计含有抗药性基因的外源DNA载体，然后通过选择性培养基进行转染细胞的筛选。也可通过提取转染细胞的DNA，以适当限制性内切酶酶切后进行Southern转移分析，检验细胞中是否有被转移的外源基因。10.2转基因

4、动物转基因动物（transgenicanimal）：在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地表达和遗传给后代的遗传工程动物。10.2.1发展历史1974年，贾英利斯和明茨应用显微注射法，在世界上首次获得AV40DNA转基因小鼠。1980年，戈登等人首次育成带有人胸苷激酶基因的转移小鼠。1982年，帕尔米特等人将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，获得比普通对照小鼠生长速度快2~4倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”。随后的几十年里，转基因动物技术飞速发展。10.2.2转基因动物的制备一、原理与方法生产转基因动物的关键技术：外源目的基因制备；外源目的基因有效

5、的导入生殖细胞或胚胎干细胞；选择获得携有目的基因的细胞；选择合适的体外培养系统和宿主动物；转基因细胞胚胎发育及鉴定；筛选所得的转基因动物品系。10.2.2转基因动物的制备方法：1. 原核期胚胎显微注射法2. 反转录病毒感染法3. 胚胎干细胞方法4. 精子载体法：精子与DNA混培养，精子携带DNA进入卵子5. 人工酵母染色体法：百万碱基对的巨大基因，整合率较高6. 受精前卵细胞显微注射法7. 其他方法：电脉冲法、染色体片段注入法、磷酸钙共沉淀法、微弹轰击法、基因剔除、基因嵌入等3种转基因的方法及其与发育阶段的关系：DNA反转录病毒感染或DNA转染或电转移胚胎干细胞显微注射囊胚受精卵四细胞

6、期原肠胚转基因动物DNA显微注射DNA反转录病毒感染转基因动物鉴定技术：早期采用的、也是目前最有权威性的转基因动物鉴定技术是Southernblot。提取待检动物组织的染色体消化后电脉，转膜后选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。斑点杂交：提取动物DNA，点于硝酸纤维素膜，探针杂交，放射自显影。聚合酶链式反应（PCR）：PCR扩增产物序列分析即可鉴定。染色体原位杂交：（？）目的基因的制备目的基因的来源1.采用限制性内切酶，从基因细胞中获取目的基因2.通过mRNA合成cDNA3.人工体外合成DNA片段4.聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段目的基因的克隆1.通过载体在适当的

7、宿主中克隆（1）基因克隆的载体载体的选择与改造应具备：提供在适当宿主细胞中复制的信号，或能整合到宿主染色体上与基因组一起复制；有增殖非必须的DNA区域，并含单个内切酶位点，以便外源DNA共价连接（插入或取代该区段），形成重组子可在宿主细胞内复制和增殖；分子量不宜过大，以便于DNA体外操作；载体DNA易与宿主核酸分开，便于提纯；具有筛选标记，以区别阳性重组子和阴性重组子，选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型、形成噬菌斑的能力等。目的基因的克