骨髓间充质干细胞促进肾脏缺血再灌注损伤修复的实验研究

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1、‘Y957盟1纠犬硕士学位论．--文、≮、．、。、(2006届)髓阿充质干细胞促进肾脏缺血母灌注损伤_，7修复的实骀研究‘、ExperimentalStudyOilth，eContributionofBoneMarrowMesenc-hymalStemCells．toRenalRepairof一●lsehemia-ReperfusionInjury·‘研究生姓名：：：堡堡o：～．指导教师姓名：．旦：．墨!整蕉!二：：——专业名称一一．．!生．．壁．堂一．．⋯一～、研、究万向：．：：鲨垦皇￡壁：：．．：一_．_、，．7论文器衮日期．：一2QQ鱼生堡：旦。一——一：、．、、‘，

2、。'。骨髓问充质干细胞促进肾脏缺血再灌注损伤修复的实验研究骨髓间充质干细胞促进肾脏缺血再灌注损伤修复的实验研究中文摘要目的：急性肾功能衰竭(Acuterenalfailure，址江)是临床常见之危重症，死亡率较高，目前治疗方面仍缺乏有效的手段。缺血再灌注损伤引起的急性肾小管坏死是ARF的常见病因，其病理特征为肾小管梗阻、肾小管滤过液回漏和滤过功能障碍。因此促进肾小管上皮的再生和肾小管结构的重建是治疗ARF的关键。本实验应用缺血再灌注肾脏匀浆和全反式维甲酸对大鼠的骨髓间充质干细胞(mesenchymlstemcells，MSCs)进行诱导，探讨体外诱导MSCs向肾小管上皮样细

3、胞分化的可能性；同时对缺血再灌注肾脏损伤的大鼠行MSCs静脉移植治疗，观察MSCs在大鼠体内的分布情况以及对肾脏修复的促进作用。方法：1．体外实验：采用梯度离心和贴壁筛选法分离纯化MSCs，取第三代的MSCs进行诱导。在MSCs的培养液中加入全反式维甲酸，终浓度为5“M；同时将装有缺血再灌注损伤大鼠肾脏匀浆的插入式嵌合培养皿置于MSCs的培养板中，以此对MSCs进行诱导，分别于0d、3d、5d、7d时对诱导的MSCs细胞进行大体形态学观察、超微结构观察、细胞组织化学染色、胞浆内第18型角蛋白(CKl8)流式细胞仪测定。骨髓闻充质千细胞促进肾脏缺血再灌注损伤修复的实验研究2．

4、体内试验：选用72只雌性6周龄SD大鼠进行动物实验。随机将大鼠分为四组：1)正常对照组(n=6)：观察正常大鼠血液学指标和肾组织结构；2)假手术对照组(n_6)：行开腹手术，而不夹闭肾蒂；3)缺血再灌注(I瓜)组(n=30)：夹闭肾蒂45min，建立双侧肾脏缺血再灌注损伤模型，再灌注60min后，股静脉输注生理盐水；4)骨髓间充质干细胞(MSCs)组(n=30)：夹闭肾蒂45rain，建立双侧肾脏缺血再灌注损伤模型，再灌注60min后，股静脉输注经5一溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记的MSCs细胞悬液(1X106／m1)。分别于再灌注后12h、3d、7d、14d、42d随机

5、选取I／R组大鼠和MSCs组大鼠各6只，麻醉下收获肾脏标本和血标本。血标本经全自动生化分析仪测定肾功能指标尿素氮和肌酐值；所有肾脏标本常规病理切片，用HE、PAS染色观察组织学变化，TUNEL法检测原位凋亡，免疫组化法检测细胞增殖情况，激光共聚焦显微镜观察MSCs分布及分化情况。结果：1．体外实验：MSCs经诱导后大体形态变为圆形、椭圆形或短胖梭形，细胞逐渐呈鹅卵石样排列。经诱导的细胞CKl8表达阳性率于0d、3d、5d、7d分别为3．27％、20．5％、38．4％、79．5％，阳性率逐渐升高。诱导第7d细胞超微结构出现微绒毛和紧密连接。MSCs未经诱导时碱性磷酸酶(ALP

6、)染色阳性率为5％，诱导第7d，ALP染色明显增强，阳性率为72．3％。2．体内试验：再灌注后12h、3d，MSCs组Scr值分别为66．35士23．89骨髓问充质干细胞促进肾脏缺血再灌注损伤修复的实验研究中文摘要Ixmol／L、34．89-士7．19I．tmol／L与I／R组(分别为146．45+33．741amol／L、103．8+55．73Ixmol／L)相比明显降低(P<0．05)，MSCs组BUN值分别为23．32士4．35mmol／L、6．48+2．25mmol／L与I／R组(分别为31．3-+-3．93mmol／L、23．5+12．43mmol／L)相比明显降

7、低(P<0．05)。MSCs组大鼠的肾脏于再灌注后12h、3d、7d组织学评分分别为6．9士1．03、6．03土1．47、4．27士1．17较I／R组(分别为7．97+1．07、7．37+1．39、5．93士1．36)明显减低(P<0．05)。再灌注后12h，TUNEL法显示MSCs组凋亡细胞数为19．4+4．37较I／R组减少(26．07士4．88，P<0．05)。再灌注后12h、3d、7dMSCs组PCNA阳性细胞数分别为42．53士7．10、36．43+10．72、49．93士7．61较I／R组(9．87士3