有机磷农药的酶免疫化学研究

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1、中国农业大学博士学位论文有机磷农药的酶免疫化学研究姓名：韩丽君申请学位级别：博士专业：农药学指导教师：揭念芹;钱传范20030601摘要农药小分子的酶免疫化学研究可以是针对单个化合物制备特异性抗体。也可以针对一类化合携翰鑫“簇特雾援”藏侮靛琵避蟹多残塑免疫分援。奉论文蘩～帮分首次较为系统建铮对常翅豹二甲氧基(硫代)磷酸酯类农药他台物的共性络构进行了多残留酶免疫分析研究，台成了三种其有共性结构特征的半抗原，并成功地得到了两种具有“宽谱特肄性”的抗体。根据我国常用舶有机磷酸醋娄农药的结构特鬣，将它们归为三类：(1)势环硫代磷酸酯类，鲡擎基jc季硫磷、系螟

2、巯磷、甲萋壤啶磷等；(2)建链蘸饩磷酸鹣类，懿乐暴、乌拉硫磷等；(3)乙烯基磷酸酯类，如久效磷、磷胺、速灭磷等农药，分别针对窝们的共性结构含成了三种半抗原(分别简称为MP、SP和VP)，以期得到对结构类似化合物具有“宽谱特异性”的多克隆抗体。针对这三耪半抗疑靛活性基团特缱，通过壹接氨孵法、重氮化法、混合酸爵法娥活性酯法等方法，使之与不同酶载体蛋岛偶联，分鄹台成了天工抗琢。隘各静半铙蔗与BSA的偶联褥作为免蔽藤谶行动物免疫，分别得到了针对芈抗原MP和sP的高效价抗体(VP免疫未成功)。获得的MP和SP抗血清与相应包被原结合的中点效价均为1：12800倍

3、，终点效价均大予50000倍。采强弱接蠢争蛙ELISA方法，分别致荦基瓣蘸襞煮sp半撬簸箨为夺分予竞争麴，对其绝蹙分瓣条件进行了试验和筛选，在优化条件F建立了针对甲基对硫磷和sP半抗琢的标准抑制曲线和叫I闩方程。在此基础上进行了其它结构类似化台物的抑制试验。结果表明，甲基对硫磷对MP摭鞭抗体结台反成的150为0．13ttg／mL，该抗体对杀螟硫磷和倍硫磷表现了较商的交叉反戍性，二蠢滟150分裂为e，50p．g．／mL帮§．351tg／mL。方法砖这三静农藓鹣检测隈(120)分裂为6．7、20．9霸12。lng／mL，说明产生的抗体对三种农药均有识别能

4、力，可用于三种农药的多残留检测。采粥所建立的ELISA方法测得黄瓜中甲基对硫磷、杀螟硫磷和倍硫磷三种农药的添加同收率分别为83．10％～93．46％，80．45％～9578％和74．89％～86．78％；C．V％分别为2+36％～10．36％，5．14％～7。14％秘4．40％～6．34％，籍聚与GC潮定数攮萋本窃合，在黄l

5、羲孛静最低捡滋浓度分鞠为0,003、O．们和o．006mg／kg,均低于相应的MRL值，符台残留分析的要求。SP产生的抗体对乙酰甲胺磷、乐果、甲撼对硫磷和马挝虢磷都表现了一定的交叉反应，四静纯台匏对sP撬鞭抗嚣结合葳戏产生擦剁的

6、15e分烈为2．66、3．3l、8．261拜J14．9}tg,／mL，方法检测限(12。)努剐为o．05、o．15、O。19和O。53pg／mL。表嚼针对这种往合兹薛≥《蛙结鞠产生的撬镩对这些结构类似的化合物能够商～定的识别能力。毒死蜱是一种中等毒性的r谱有机磷农药，在国内外农业生产中大量使用。本论文第二部分程鹫内酋次进行了毒死蜂的兔痰他学疆究，荠成功铡冬了针对毒死瓣的特嚣憔抗体。麸毒燹蜱的磷酸酯乙氧基部位引入5．C间隔鹫，通过褫合酸酝法和活性酪法与不同的载体鲞自荡联，黼备了人工抗原。以冀BSA偶联物作为免疫原进行动物免疫，得到了对毒死蜱具有商度特异

7、性和亲和力的高效价抗体。抗血清与包被原结合的中点效价为12800倍，终点效价大于50000倍n采用间接竞争牲ELISA方法怼免疫分橇蔡转避暂了试验番{绽位，建立了霉琵簿豹掂准抑铡麴线帮回归方程t耋誓鹜黧态耋鏊圭茎釜鏊莲鎏蓍毒死蜱对抗原抗体结合反应的I，o为76．8ng／mL，方法对毒死蜱的检测限(120)为5．2ng／mL。除甲基毒死蜱以外(cR％为66．9％)，抗体对其它有机磷农药均不表现交叉反应。土壤、黄瓜和河水中毒死蜱麴添细回收率分别巍73．81％～89．45％、76。93％～t02．8％霸89130％～103．2％，C．V％分别为s．28％～

8、9．83％、7．62％～12．25％秘4，04％～5．18％，与Gc测定数攥基本窃台，最低援出浓度分剐为o．005mg／kg、0．003mg／kg和0．08ltedL．均低于其柱蔬菜中flqMRL值，符合残留分析的要求。利用抗体进行的酶免疫分析方法灵敏度、准确性较好，操作简便。适于大量样本的快速筛选，可作为快遴测定工具予娃开发窝翻用。关键词：有机磷农鲻：毒死蜱；酶免疫化学：残留分析；酶联免疫吸附测定2ABSTRACTTheenzymeimmuno-chemistryofpesticidesincludingthepreparationofthespe

9、cifcantibodyforsinglecompoundandthe“broadspecific”anti