《酶的免疫化学测定》PPT课件

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1、第五节酶的免疫化学测定二十世纪70年代以来，随着免疫学技术的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶的免疫化学测定法。与经典的测定酶活性方法比较，这些方法不仅灵敏度高，而且能测定一些以前不易测定或测定条件不易掌握的酶。(一)测定原理放射免疫测定(RIA)分为直接法与间接法。直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定。间接法是将样品中无放射性的酶蛋白与放射性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞争，根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白量。以间接法为最常用。另外还有免疫抑制法、化学发光免疫测定(CL

2、IA)、酶免疫测定(EIA)、荧光酶免疫测定(FEIA)等。报告方式有两类：一类是用酶活性浓度单位，如免疫抑制法测定CK-MB酶活性(actiyity)，结果常以U／L报告；另一类是用质量浓度单位，如用免疫学方法测定CK-MB酶质量(mass)(即蛋白量)，结果常直接用ng／ml或6μg／L报告。(二)免疫化学测定的优缺点血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化两种情况。酶在一些病理条件下或受操作条件等影响而失活，一些激活剂或抑制剂对酶活性也有影响，因而酶活性常不能正确反映酶的情况，出现酶活性与酶蛋白绝对量不一致，有时甚至出现两者变化完全相

3、反的情况。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：①灵敏度高，能测定其他方法不易测出的少量或痕量酶；②特异性高，不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响；③能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；④特别适用于同工酶的测定。酶的免疫化学测定也有其局限性。主要有：①要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且工作量很大；②测定步骤多，操作繁琐；③测定成本高。第六节同工酶及其亚型测定一、概念同工酶是同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具

4、有相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。亚型某些酶或同工酶从组织进入体液后，可进一步变化为数个不同类型即所谓“亚型，也称为同工型(isoform)”。即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。亚型往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。三、分析方法临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性。(一)电泳法1．方法电泳法的使用最为广泛。此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。目前国内外

5、的一些自动化电泳分析系统则多采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分离与鉴定。此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。测定步骤主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。用电泳法进行区带分离的原理与其他蛋白电泳相似。2．显色染料常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易溶于水，难溶于一般的有机溶剂。酶学中只是利用所进行的偶合反应，由所生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测，四唑盐起着受氢体的作用，如将四唑盐及双四唑盐分别还原成紫红色的甲躜(formazan)和紫蓝色的双甲躜。常用的四唑盐有：硝基四唑蓝盐

6、(NBT)，碘化硝基四唑盐(INT)、甲基噻唑四唑盐(MTT)等。其中NBT生成的色素难以溶解，在局部区域染色良好，使用最多。3．扫描定量显色后的区带一般用光密度计或荧光计扫描定量分析。或将薄膜或凝胶切割成小条或小薄片，分别浸泡在含缓冲液的试管中，低温下将酶条带洗脱，再进行比色分析，亦可计算出各同工酶或亚型区带的活力。图6-6为琼脂糖凝胶电泳分离的血清LD同工酶谱(图谱中从左至右分别为LD1-LD5)。4．注意事项用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：①酶与免疫球蛋白形成的复合物，如CK—BB-Ig

7、G、CK-MM-IgA、LD-IgA等；②酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD-β-脂蛋白；③酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CK—Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。如患者临床症状不明显，血清酶活性不正常，同工酶图谱异常时要特别警惕血清中有无巨分子酶，以免造成对酶测定结果的错误判断和临床误诊。(二)色谱法常用色谱法是柱色谱，如离子交换色谱和亲和色谱等用于同工酶的提纯与制备，但方法费时繁琐，通常不适合临床同工酶常规检测。目前国外已有供临床同工酶分析用的商品化微型色谱柱。也有应用阴离子交换色谱结合免疫化学法、聚焦色谱结合电化学检测法