SodiumBenzoate对多巴胺能神经元的毒性作用及机制研究

《SodiumBenzoate对多巴胺能神经元的毒性作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学博士学位论文SodiumBenzoate对多巴胺能神经元的毒性作用及机制研究姓名：陈倩申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：谢富康;李朝红20090512中山大学博士学位论文SodiumBenzoate对多巴胺能神经元的毒性作用及机制研究3．通过整体原位杂交检测TH和DATmRNA在3dpf斑马鱼胚胎中的表达，以及利用整体免疫荧光检测TH蛋白在3dp戚马鱼胚胎中的表达，来比较sB和MPTP对斑马鱼间脑腹侧DA能神经元的损伤作用；4．通过行为学检测观察SB对6dpf斑马鱼幼鱼活动能力的影响；5．大鼠PCI2肾上腺嗜铬细

2、胞瘤细胞的培养、传代，及生物学特性研究：PCI2细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基中，至90％融合时用胰酶消化，调节细胞密度为(3"--5)×105／ml传代；分别计数培养0．-一8d的细胞数，并绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间；6．利用免疫荧光法检i贝!JPCI2细胞中NF200及TH的表达；7．饥饿同步化处理后的第3"--4代细胞，通过形态学观察SB对PCI2细胞形态发育的影响；用MTT法检测SB对PCI2细胞活性的影响；通过Westemblot的方法观察不同浓度(10--一50mM)SB作用对PCI2细胞TH表达水平的影响

3、；进一步用DAPI染色和流式细胞术证实SB可诱导PCI2细胞发生凋亡，并比较不同浓度(10～50mM)SB所致PCI2细胞凋亡率的差异；8．用Westernblot方法检测不同浓度(10--一50mM)SB作用于PCI2细胞24h后，JNK和ERK磷酸化水平的变化；以及40mMSB作用于PCI2细胞(0--一24h)后，JNK和ERK磷酸化水平的变化；9．用Westemblot方法检测JNK的特异性抑制剂SP600125预处理30min，再加入SB分别作用lh和3h后，JNK和ERK磷酸化水平的变化。结果：1．建立了适合本实验室条件的斑马鱼

4、繁育系统，并能顺利获得满足下游实验要求的高质量的受精卵；2．在斑马鱼胚胎发育的各个时期，低浓度SB(40gg／m1)处理后未见明显降低胚胎的生存率(P>O．05)；然而，随着SB暴露持续时间的延长以及浓度的增加(从100到800I．tg／m1)，生存率明显降低；3．SB暴露能够引起心包浮肿、卵黄囊再吸收迟缓、卵黄囊水肿、体长缩短、脊柱弯曲等明显的畸形改变；同时，胚胎的畸形率随着SB浓度的增加而增加；4．斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的SB(40和100“g／m1)至3dpf能够明显下调中山大学博士学位论文SodiumBenzoate对多巴胺能神经

5、元的毒性作用及机制研究TH基因在腹侧间脑神经元中的表达(对照组1004-7．2％比51．424-4．1％和36．78+4．59％，分别以40和100lag／mlSB处理；P<0．001，与对照组术ILh)与40gg／mlSB处理组相比，100gg／ml组的作用明显更为剧烈(P

6、，SB同样能够诱导腹侧问脑神经元中DAT的表达发生明显下调(对照组100-a：8．8％比56．44+8．8％、41．134-3．9％、48．834-7．3％，分别对应于401ag／mlSB、100gg／mlSB，和45lag／mlMPTP处理；P<0．001，与对照组相比)；并且SBl00gg／ml的下调作用比40gg／ml组要更为严重(P=0．002)；6．SB的暴露处理引起斑马鱼幼鱼活动能力的明显降低(P<0．001，与对照组相比)；且在相同浓度SB暴露状态下，SB的早期暴露要比晚期暴露的作用影响更为明显(P<0．001)；7．普通培养

7、条件下的PCI2细胞贴壁生长，胞体较小，胞核大，圆形，多为单核，偶可见双核或核分裂相，核浆比大，有较多突起；体外培养的PCI2细胞群体倍增时间为(24．714-0．59)h；免疫荧光显示，PCI2细胞NF200和TH的表达均为阳性；8．SB可呈时间和浓度依赖性降低细胞活性；其中40mMSB作用24h后对PCI2细胞的活性抑制率为47．81+5．23％；9．低浓度(10mM)的SB可增强PCI2细胞中TH的表达，而高浓度(40"--50mM)的SBN可降低TH的表达；同时，SB可呈时间依赖性降低TH的表达；10．SB可诱导PCI2细胞核形态呈

8、凋亡改变；进一步利用FACS检测，可发现细胞凋亡所形成的亚二倍体凋亡峰，其峰值随SB浓度的增加而增JJll；11．SB以浓度依赖性增力nPCI2细胞JNK的磷酸化水平，同时以浓度