J克隆DNA的分析与应用

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1、J克隆DNA的分析与应用克隆的鉴定聚合酶链反应J1克隆的鉴定克隆的鉴定：现在对克隆进行部分或全序列的测定往往是第一步。虽然序列分析可提供推测基因的大小、限制图谱以及方向或者可读框（ORF），但仍须有实验证明推测基因确实在某生物体的一些细胞中转录成RNA，而对于那些编码蛋白的基因还要证明所预测大小的蛋白确实在体内被合成。鉴定的内容：鉴定前需要纯化已克隆的DNA样品测定重组DNA分子的大小、限制图谱、基因的方向以及核苷酸的序列。限制图谱用一种或两种以上的限制酶对重组DNA分子进行酶解，可以构成标明该DNA分子的酶切位点和片

2、段大小的限制图谱。一个限制图谱代表特定限制酶识别靶位点的线性序列。限制图谱中的距离直接用碱基对(简写bp)来测量，而较长的距离用kb表示，指DNA中1000个碱基对或者RNA中1000个碱基。在染色体水平上，图谱用兆碱基对表示(1Mb=106bp)。限制性图谱(Restrictionmap)是用限制性内切酶将DNA切割成片段，然后测定片段之间的距离建立的。它以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影后显示出

3、目的DNA或RNA分子所处的位置。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：(1)Southern杂交:DNA片段经电泳分离后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。(2)Northern杂交:RNA片段经电泳后,从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。DNA与RNA的杂交基因测序PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸

4、基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获J2聚合酶链反应（PCRpolymerasechainreaction）原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR的基本原理引物1引物2DNA引物PCR的基本原理引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR的基本原理第1轮结

5、束第2轮开始PCR的基本原理TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理第2轮结束模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增原理：DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。首先是dsDNA在高温下变性成为ssDNA，然后DNA聚合酶以ssDNA为摸板，利用聚合酶和dNTPS合成新生的DNA互补链。新合成的dsDNA经过变性、复性、延伸。如此反复循环，使目标DNA以指数形式扩增。应用：扩增与分离目的基因；临床医疗诊断；胎儿性别鉴定；癌症治疗监控；基因突变与检测；分子进化研究；

6、法医鉴定；商品检疫新药品的开发PCR反应组份模板引物（1对）Taq酶dNTP缓冲液（含Mg2+）聚合酶链反应(PCR)利用与DNA模板序列的两端互补的一对寡聚核苷酸引物来扩增一段DNA序列。由一种热稳定的DNA聚合酶经三步反应即变性、引物退火和聚合的循环从两个引物来相对延伸。pre-denaturation--DenaturationannealingElongationcycles:25-30模板因为可实现大量的扩增，有时在少至一个起始模板分子的情况下也能实现PCR扩增。因此任何可提供一个或多个目的分子的DNA原则上

7、都能用作PCR的模板，包括血液、精子或任何其他组织，如较早的法医标本、古生标本制备的DNA、或者从实验室里的细菌菌落或噬菌斑制备的DNA以及已纯化的DNA。无论模板DNA来源如何，只要已知一些序列信息从而能设计出引物的DNA就能应用于PCR扩增。引物每一对PCR引物需18—30核苷酸，并且在一对引物间的G＋C含量相似，以致使它们在相近的温度下与其互补序列结合。对于短的寡核苷酸(＜25nt），退火温度(℃)可用下式计算：Tm＝2(A+T)+4(G+C)。如果PCR产物要用于克隆，最好在引物5’端加上单一的限制酶切位点。如

8、果目的DNA序列是未知的，例如克隆一个只知道部分氨基酸序列的蛋白的cDNA，设计引物就会比较困难。因此可通过遗传密码解出编码已知氨基酸序列的DNA序列，再设计出简并引物。酶其中最常用的Taq聚合酶是从Thermusaquaticus菌中制备的。该酶能经受l－2min95℃变性步骤，在该温度下的半衰期大于2h。由于不具备3’－5’的