《dna克隆》word版

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1、人类基因组计划的主要内容：1、阐明人类基因组序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置。2、破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。3、解码生命、了解生命的起源和生命体生长发育规律。4、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象，为疾病的诊治提供科学依据。引物设计的原则：1、引物的长度以15-30bp为宜。2、（G+C）的含量45-55%，引物的Tm值可用共识计算：﹛Tm=4（G+C）+2（A+T）﹜。3、避免两引物间的互补，以免形成引物二聚体。4、引物一定要与模版DNA配对。5、

2、引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的DNA有高度互补，才能使用。蛋白质一、二、三、四级结构及其相应功能：1、一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构(primarystructure)。这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。2、二级结构：指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元。主要有以下类型：（1）α－螺旋（2）β－折叠（3）β－转角（4）无规则卷曲。3、三级结构：多肽键在二级结构的基础上，通过侧

3、链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使α－螺旋、β－折叠片、β－转角等二级结构相互配置而形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。4、四级结构：指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。琼脂糖凝胶电泳的原理：在一定PH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内他们在相同电场中泳

4、动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。在当低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10mg的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。（特点：电泳支持介质：琼脂糖；琼脂糖凝胶电泳分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段，其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，但制备容易，分离范围广，尤其适当分离大片段DNA。）转录的机制：1、起始，RNA聚合酶是负责转录的酶，它结合到被称为启动子的特定DNA序列上以起始RNA的合成。这些序列位于蛋白质编码区的上游(5'端

5、)，含有一些短而保守的DNA序列，在不同启动子中这些序列是相同的。RNA聚合酶结合到双链DNA的启动子序列上，引起DNA局部解旋。合成第一个RNA碱基的位置称为起始位点，其位置称为+1。2、延伸.RNA聚合酶沿着DNA链移动，顺次合成RNA链。DNA在移动的聚合酶抵达之前解旋，在其经过之后又恢复成双螺旋。3、终止，RNA聚合酶识别终止子，导致不再有新的核苷酸插入，该序列通常是发夹结构。蛋白质翻译机制：1、起始①30S亚基与mRNA的结合:在一定Mg2+的生理条件下,核糖体亚基很容易缔合,所以70S核糖体在IF3作用下解离,然后再形成30S-IF

6、3复合物,接着与mRNA结合.②30S-IF3-mRNA与起始tRNA结合:在IF1和IF2的作用下和GTP的参与下,30S-IF3-mRNA与起始fMet-tRNAf结合,形成30S起始复合物30S-mRNA-fMet-tRNAf-GTP-IF1-IF2,并释放出IF3.③70S起始复合物的形成:50S的加入和GTP的水解,形成70S起始复合物70S-mRNA-fMet-tRNAf,释放出IF1和IF2.fMet-tRNAf位于核糖体的P位上.2、延伸①aa-tRNA与核糖体结合:在氨酰tRNA合成酶催化下,氨基酸被专一的tRNA所携带,生成

7、aa-tRNA在EF-Tu和GTP作用下强烈促进aa-tRNA与核糖体A位结合.②肽键形成:aa-tRNA结合于核糖体A位后,在肽基转移酶催化下,将P位tRNA上的肽基通过其羧基与A位tRNA上氨基酸的α-氨基连接,形成肽键.③移位:肽键形成后,核糖体处在前移位状态,这时占领P位的是去酰化tRNA,A位为肽基tRNA,然后进行移位,核糖体与mRNA相对移动一个密码子距离,肽基tRNA从A位移至P位,去酰化tRNA离开P位,移位被EF-G催化,随之GTP水解,并导致EF-G释放.3、终止：肽链延伸过程中,当终止密码子UAA,UGA,UAG出现在核

8、糖体的A位时,没有相应的aa-tRNA可以与之结合,而释放因子在GTP存在下,却能识别这些密码子并与之结合,激活肽基转移酶,把P位上的肽基转移至水分子