双TDNA共转化获得转基因番木瓜的研究

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1、福建农林大学博士学位论文双T-DNA共转化获得转基因番木瓜的研究姓名：何玮毅申请学位级别：博士专业：果树学指导教师：陈晓静;潘东明20090401福建农林大学博士学位论文双T-DNA共转化获得转基因番木瓜的研究中文摘要基因前的CaMV35S启动子，经由农杆菌EHA105介导侵染番木瓜不同组织器官，发现其具有明显的启动子功能，为伤诱导类型，并与特定器官的发育相关。GUS活性在果肉中最强，其次为胚和根部，其它器官中则不表达。4．构建了用于番木瓜遗传转化的植物表达载体。将∥-cat基因保守区反向重复插入载体pKANNIBAL构建RNAi中间表达载体pKAN／RG。将其上发夹结构取

2、代经改造的载体pCAMBIA1300上hptII基因，构建中间表达载体p1300"／MFRG。分离其上单T-DNA区段，与载体pCAMBIA2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301／TTRG。将两端含有BamHI和SalI粘性末端的fl-Gal基因启动子片段、p2301／TTRG经XbaI和BamHI双酶切后的大片段和p2301／TTRG经XbaI和SalI双酶切后的小片段相连接，构建含有果实特异性启动子的RNAi双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测表明，p2301／TTRG和p2301／BPTTRG均被成功导入农杆菌EHA105，可用于后续的遗传转

3、化研究。5．开展了以携带植物表达载体p2301frTRG的农杆菌EHA105介导的番木瓜遗传转化方法和体系优化的研究。探索了液体振荡转化法、浸泡转化法、体胚针刺法和茎段转化对番木瓜转化效率和共转化效率的影响，以前两种方法的效果较好，以浸泡转化法的“100J_tmol·L。1AS+菌液OD为0．2+侵染20min+共培养2d”为本试验的最佳转化组合；“1001．tmol·L。1AS+菌液OD为O．2+侵染20min+共培养3d”为最佳的共转化组合。后两种方法则不太适于番木瓜的遗传转化。最终，获得了5株转基因再生植株，经PCR和Southern杂交检测结果表明，只有2株为共转化

4、的结果，诱导了其中1株生根并移栽。6．开展了番木瓜转BPTTRG基因和转MFRG的初步研究。利用浸泡转化法，以携带植物表达载体p2301／BPTTRG和p1300-／MFRG的农杆菌EHA105，分别侵染CIIb型胚性愈伤组织。前者获得了经GUS染色、PCR检测和Southern杂交结果为阳性的共转化转基因番木瓜再生植株。后者从198株再生植株的62个DNA混合池中，PCR检测出了两个阳性池。进一步对混合池中的单株分别进行PCR检测，则未能成功分离出转基因植株，在不含抗生素选择压的条件下的遗传转化可能出现了嵌合体现象。以上研究获得的双T-DNA共转化的转RNAi-fl-Ga

5、l基因番木瓜植株，有望通过一次有性杂交，选育无选择标记基因的抗软化转基因番木瓜，在一定程度上解决转基因食品的安全性问题。关键词：番木瓜；伊半乳糖苷酶；动子；RNA干扰；双T-DNA；遗传转化．福建农林大学博士学位论文双T-DNA共转化获得转基因番木瓜的研究AbstractThemainfactorlimitingthecommercialproductionofCaricapapayaL．1iesinthedeteriorationoffruitcausedbyrapidsofteningduringpostharveststorageandflesh—cutprocess

6、ing．Inthispaper,thekeyhydrolyticenzymefl-GALs，whichwereresponsibleforthecellwalldegradationandthusthefruitsofteningduringpostharvestripeningofpapaya,wereaimedatforthedeterminationofrelationshipbetweenitsexpressionandfruitsofteningatthemolecularlevel，ontheadvancesofresearchesofpostharvestph

7、ysiologyandgenetictransformationofantisenseACSandACOgeneforpapaya．TheCO-transformationtransgenicpapayawasobtainedusingCO-cultivationofembryogeniccalliwithAgrobacteriumtumefaciensharboringaR'NAi··two··ToDNAplantexpressionvectordrivenbypromotercharacterizedwithf