基因工程菌生长代谢的特点

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1、第五节基因工程菌生长代谢的特点菌体的生长通常用比生长速率来表示。控制菌体的生长对提高质粒的稳定性、减少代谢副产物积累、提高外源蛋白产率有重要意义。工程菌培养可通过选用不同的碳源控制补料和稀释速率等方法来控制菌体的生长。大肠杆菌的蛋白/菌体量的比值是基本恒定的，因而菌体的生长速度反映了蛋白质的合成速度。培养条件的改变，都会改变菌体的能量代谢和小分子前体的供应，影响生物大分子的合成和菌体的生长。一、菌体的生长与能量的关系碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，

2、菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用。分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。大肠杆菌中克隆携氧能力的VHB蛋白的基因，以提高菌体的氧摄取能力，可提高菌体比生长速率和菌体密度。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。二、菌体生长与前体供应的关系前体：细胞从外界吸收的或在代谢途径中形成的，可被进一步转变成终点产物的化合物在基

3、础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，导致工程菌生长速率降低。质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。ppGpp是一个重要的调控分

4、子。它的浓度增加会导致在合成mRNA和rRNA时RNA聚合酶在模板上的移动产生停顿，RNA链延长速度减慢，使游离的RNA聚合酶浓度降低，严紧控制的启动子如rrnA等的转录减少。也可能ppGpp是通过干扰RNA聚合酶与PL启动子专一识别反应。第五节基因工程菌的不稳定性基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。质粒不稳定可分为：分裂不稳定结构不稳定结构不稳定指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。分裂不稳定指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。一、质粒不稳定产生的原因1.常见分裂不稳定的两

5、个因素⑴含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌、质粒特征和培养条件有关。⑵这两种菌比生长速率差异的大小。丢失质粒的菌体在非选择性培养基中一般具有生长优势，在培养中会逐渐取代质粒菌而成为优势菌。批菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长速率时质粒拷贝数下降。生长速率/h0.20.4质粒拷贝数10.5×10950400β-半乳糖苷酶工程菌的连续培养32.常见结构不稳定的因素：质粒自发缺失与质粒中短的正向重复序列之间的同源重组有关，具有两个串联启动子的质粒更容易发生缺失；在无同源性的两个位点之间也会

6、发生缺失，培养条件也会对质粒结构不稳定产生影响。质粒稳定性的分析方法样品不含抗性标记抗生素平板培养基10-12h100个菌落含抗性标记抗生素平板培养基10-12h统计生长菌落数重复三次,计算比值(稳定性stability)二、提高质粒稳定性的方法1选择合适的宿主菌宿主菌的遗传特征对质粒的稳定性有很大的影响。宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特征、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。2选择合适的载体与载体在宿主菌中的拷贝数有关。低拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率高，增加工程菌质粒拷贝数可提高

7、稳定性；高拷贝质粒工程菌产生不含质粒子代菌频率低，但对稳定性不利。对同一工程菌控制不同的比生长速率可改变质粒的拷贝数。3选择压力在培养基中加选择性压力抗生素，可以抑制质粒丢失菌的生长。添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力。大规模生产时不可取。4分阶段控制培养第一阶段先使菌体生长至一定的密度，使质粒稳定地遗传，第二阶段诱导外源基因的表达，由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。5控制培养条件通过调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度、限制性营养物质来控制比生

8、长速率。6固定化不同的宿主菌及其质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。第八节重组工程菌的培养基因工程菌的培养过程包括:⑴通过摇瓶操作基因工程菌生长的基础条件,如温度、pH、培养基各种组分、碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;⑵通过培养罐操作确定培养参数和控制方案以及顺序。菌种一级种子摇瓶二级种子罐培养扩大培养原料发