苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生研究

《苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、苏云金芽苞杆菌原生质体制备与再生研究苏云金芽抱杆菌原生质体制备与再生研究摘要：主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间和酶解温度对苏云金芽抱杆菌原生质体制备和再生的影响O通过正交试验确立了苏云金芽抱杆菌制备和再生的最佳条件，当酶浓度为1.Omg/mL,酶解时间为80min,酶解温度为30°C时，原生质体的制备率和再生率达到最高，分别为98.14%和58.14%。关键词：苏玄金芽砲杆菌；原生质体；制备；再生中图分类号S476.1文献标识码A文章编号1007-7731（2014）03-04-20-02引言基因组改组技术是近几年迅速发展的微生物育种技术，在菌种特性改良和提高产量等方

2、面取得了一系列成果［1］。原生质体制备、再生与融合技术是基因组改组育种的重要技术基础，市丁各种微生物细胞壁的组成和结构不同，不同菌种原生质体制备和再生的条件也不相同［2-3］,较高的原生质体制备率和再生率是育种成功的必要条件。本研究拟开展苏云金芽孑包杆菌基因组改组菌种选育，通过酶解法制备苏云金芽抱杆菌原生质体，主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质体制备和再生的影响，优化出原生质体制备与再生的最佳条件，为进一步进行原生质体的融合、选育优良重组的菌株奠定基础。1材料1.1菌种苏云金芽抱杆菌FS42,本实验室保藏。1.2培养基（1）斜面（平板）培养基（g/L）

3、：牛肉浸膏3,蛋白月东10,氯化钠5,琼脂20。pH7.0~7.2o（2）再生培养基（g/L）：牛肉浸膏3,蛋白月东10,氯化钠5,琼脂20,蔗糖171.15opH7.0〜7.2。（3）种子培养液（g/L）：牛肉浸膏3,蛋白月东10,氯化钠5。pH7.0〜7.2。2方法1.1菌种活化从保种斜面挑取一环，平板划线，37°C恒温培养箱放置24ho2.2种了培养从活化的平板上挑取成熟的单菌落接入种了培养基(装液量50mL/250mL三角瓶)，置于30°C230r/min恒温摇床振荡培养llh。2.3原生质体制备与再生2.3.1原牛•质体的制备(1)挑取成熟的单菌落接入液体培

4、养基(装液量50mL/250mL三角瓶)，置于30°C230r/min恒温摇床振荡培养llh,2%转接新鲜的液体培养基(装液量50mL/250mL三角瓶)，恒温摇床振荡培养3h,加3%的廿氨酸，继续培养4h。(2)吸取3iiiL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40°C水浴低速振荡60mino(3)吸取0.lmL菌液，用无菌水稀释至一定梯度，吸取0.lmL涂于平板上，37°C培养24h,计算其菌落数(A值)。2.3.2原生质体的再生(1)用高渗缓冲液将制备好的原生质体悬液稀释至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培养基，37°C培养24h,计算其菌落数(C值)。

5、(2)吸取O.lmL制备好的原牛质体悬液，用无菌水稀释至一定梯度，静置20min,使其充分胀破，最后吸取0.ImL涂于平板上，37°C培养24h,计算其菌落数(B值)。2.3.3制备率和再生率计算公式(1)制备率(%)=(A-B)/AX100；(2)再生率(%)=(C-B)/(A-B)XIOOo其中，A：总菌落数；B：未被酶解的菌数；C：原生质体再生菌数与未酶解菌总数。3结果与分析3.1单因素试验优化3.1.1溶菌酶浓度对原生质体制备与再生的影响采用酶法制备苏云金芽抱杆菌FS42原生质，取预培养的菌液(接后培养3h,加3%廿氨酸，继续摇瓶培养4h),其它制备条件不变，

6、溶菌酶浓度为0.5mg/mL>0.75mg/mL>1.Omg/mL,以考察不同浓度对原生质体制备与再生的影响，结果见图1。从图1可以看出，当溶菌酶浓度为1.Omg/mL吋，原生质体制备率达到最高，为82.63%,原生质体的制备率随酶浓度的增加而升高，但提高幅度较缓慢。当溶菌酶浓度为0.5mg/mL时，再生率达到最高，而随着酶浓度的增加，再山率逐渐下降，由12.1%下降至3.14%。由此可见，酶浓度的增加不利于原生质体的再生。虽然高浓度的酶制备率比较高，但再生率却很低。其原因可能是高浓度的溶菌酶使细胞壁被裂解得太彻底，进一步对原生质体产生毒害，使其失去再生能力,从而再生

7、率下降。2.1.2酶解吋间对原生质体制备与再生的影响采用0.5mg/mLjiff溶菌酶酶解，其它制备条件不变，分别酶解作用40min.60min.80min,考察不同酶解吋间对原纶质体制备与再&的影响，结果见图2。结果表明：酶解时间对其原生质体制备率和再生率有较大的影响。当酶解时间为60min,制备率与再生率的乘积达到最大,若继续延长裂解的时间，虽然制备率有略微上升，但其再牛率快速下降，造成这种结果可能是因为：原生质体的形成需要一定的酶解时间，酶解时间太短,则形成的数量少，直接影响其再生率；若时间太长，酶活力显著下降冃脱壁太彻底，使细胞壁失去再生的引