猪苓原生质体制备及再生研究

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1、猪苓原生质体制备及再生研究［摘要］对猪苓原生质体的制备与再生进行了研究，结杲表明：2.66%蜗牛酶+1.33%纤维素酶的组合酶液,在温度为28°C,pH自然，渗透压稳定剂为甘露醇（O.OlO90mL）,茵龄12d的菌丝体酶解5h,原生质体的产率约5.60X106个/mL。再生率约17.45%.［关键词］猪苓；原生质体；分离；再生引言猪^-（PolyporusumbeUatus（Pcrs.）Fr.）,又称猪茯苓、地乌桃，俗称野猪粪，属于真菌门、非褶菌门、担了菌亚门、层菌纲、多孔菌科、多孔菌属⑴。分布于我国河南、河北、安徽、浙江、福建、湖南、湖北、山西、陕西、廿肃、贵

2、州、青海、内蒙、四川、云南、东北等地，主产于陕西、山西、四川、云南⑵。猪苓主要由子实体和菌核两部分构成。猪苓子实体也叫“猪苓花J“T层蘑姑”，质地柔软，味道鲜美，可以食用。子实体从埋在地下的菌核上长出，其上冇担抱了，是进行冇性繁殖的部位。了实体呈树从状，主柄短，其上生冇10-100余朵扁圆形的小子实体。菌盖肉质柔软，直径一般为l-4cm,中部凹陷呈漏斗状，冇淡黄褐色的纤维状鳞片，盖边缘薄而锐，全缘，内卷。菌肉薄，白色，纤维状肉质，干后变脆。菌管与菌肉颜色相同，菌管延生，长不超过2mmo了呈长卵圆形至圆柱形，（7〜10）xl0*6mx（2.5〜4）xl0'm,内含1

3、个直径（1.2"10〈m的大油球。抱子成熟后弹射，遇到适宜的条件就萌发成菌丝，形成新的猪苓菌核。菌核生于地下的土层中，它是由菌丝组成的一种休眠体，菌核形态多样，以长条形、块状和片状居多，冇的分枝如姜状，俗称“鸡屎苓”；冇的分枝很少，形如瘤状，俗称“猪屎苓雹菌核冇白色、灰色和黑色3种（俗称:“白苓”、“灰苓”、“黑苓5这三种不同颜色的猪苓菌核代表了猪苓三个不同的生长发育阶段⑶。猪苓入药已冇两千多年历史。在《木草纲目》上载冇“开勝理、治淋肿、脚气、白浊带下、妊娠子淋、胎肿、小便不利”，说明了猪苓冇重要的药用价值。近年来国内外研究发现猪苓含水溶性多聚糖化合物，猪苓聚糖（

4、Gu・l）,麦角倂醇（Ergostol,C28H44O）,a■矩基■卄四碳酸（a-Hydroxy-tctracosanoicacid,C24H48O3）,生物素（维生素H、Biotin）,粗蛋白等⑷,具有广阔的开发价值和应用前景。在20世纪70年代，口本学者T.Miyazaki和N.Oikawa首次从猪苓菌核中提取而成的具冇显著生理活性的一类物质猪苓多糖，并证明其对动物移植性肿瘤冇抑制作用⑸。猪苓多糖为存在于猪苓的菌丝体和了实体中的水溶性多糖，中医临床上常用于治疗急性肾炎、全身浮肿、小便不畅、尿急尿频、尿道疼痛、受暑水泻以及急性肝炎、急性胃炎等疾病。猪苓多糖的发现

5、和应用，引起了国内外学者对猪苓研究的极大兴趣。研究表明，从野生猪苓中提取的猪苓多糖是一种非特异性细胞免疫刺激剂，能显著地增强网状内皮系统吞噬细胞的功能，使癌细胞生氏受到抑制，具冇明显的抗肿瘤作用⑹，临床上用于肺癌、白血病、肝癌等放射治疗（放疗）和化学药物治疗（化疗）的辅助治疗，可提高患者的抗病能力⑺。猪苓多糖能显著降低肝脏中氧化脂质的含虽，提高细胞中超氧化物歧化酶和肝脏过氧化氢醜活力，冇清除自由:基损伤的作用，对于延缓组织细胞老化、保护机体、抗老防衰十分冇益凶。由猪苓多糖研制的静脉注射液已试用于临床，具冇吸收全、作用迅速等优点，R未发现明显毒副作用，它是一种冇效的

6、免疫促进剂。随着我国医疗保健事业的发展,以猪苓为原料的成品药也不断开发，其药用价值和经济价值都冇显著提高。而R多糖是非细胞毒性物质，毒副作用小，与化学药物为伍用可增强疗效和减轻副作用⑴，因而在保药学领域冇广阔的应用前景，H益引起人们的关注。由于野牛猪苓被大量采挖，资源越來越少，国家已将猪苓列为濒临枯竭的保护品种。70年代末,我国学者成功地从猪苓菌核屮分离岀猪苓纯菌种，开始了实验室内对猪苓纯培养的研究。同年代末,我国屮医研究院发现，猪苓菌丝体发酵液多糖与野牛菌核多糖一•样对小鼠肉瘤180腹水肿瘤细胞有明显抑制作川显示出以猪苓菌丝体发酵液多糖代替牛药猪苓的可能性，且据

7、报道，在猪苓发酵过程屮加入蜜坏菌、假单胞杆菌、灵芝、金针菇等儿种菌的发酵液对猪苓菌丝牛长和猪苓多糖产牛有明显促进作用〔⑵。通过菌丝发酵牛产多糖与传统方法从菌核屮提取多糖相比有很大的优势，用传统方法对猪苓子实体进行半人工栽培，子实体形成的周期长，经济效益低，成本高。而液体发酵法具有不受季节限制进行工业化连续牛产，具规模人，产量高，发酵周期短，生产效益高等优点。如灵芝多糖、云芝多糖、猴头多糖、香菇多糖等均已通过菌丝发酵牛产，并制成各种试剂投入市场。但目前猪苓菌丝发酵培养有关的研究十分欠缺。在工业微牛:物领域，获得高产菌株的主要途径是通过物理或化学于•段诱变产生突变体卩

8、現而在各种