灵芝原生质体制备再生与遗传转化的研究进展

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1、灵芝原生质体制备、再生及遗传转化的研究进展*徐鹏，丁重阳，钱竹，章克昌（江南大学工业生物技术教育部重点实验室生物资源与转化研究室江苏无锡214036）摘要:灵芝具有极高的药用价值和食用价值，本文从灵芝原生质体制备、再生以及遗传转化的方法等方面来阐述有关灵芝遗传改造的研究进展及应用前景。关键词:灵芝（Ganodermalucidum）；原生质体；制备再生；遗传转化AdvanceInThePreparation﹑RegenerationAndGeneticTransformationOfGanodermaProtoplastXUPeng,DINGZhong-yang,Q

2、IANZhu,ZHANGKe-Chang*(LaboratoryofBiomassandBiotransformation,KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,China)Abstract:Ganodermalucidumisfamousforitsmarvelousfunctionasamedicinalandediblefungus.Thispaperfocusontheadvanceintheprepara

3、tion、regenerationandgenetictransformationofGanodermaprotoplast,inwhichthegeneticmodificationandappliedprospectofthisfungusarediscussed.Keywords:Ganodermalucidum,Protoplast,Preparationandregeneration,Genetictransformation中图分类号：Q939.5文献标记码：A文章编号：传统中药灵芝（GanodermalucidumKarst），始载于《神农本草经》，被

4、列为历代用药的上品。有“扶正固本”的功效。现代医学大量的药理和临床实验证明：灵芝的药效十分广泛，且几乎无毒副作用。灵芝在提高机体免疫力、抗肿瘤、抗HIV病毒以及在治疗肝炎、肾炎和心脑血管疾病方面表现出显著的疗效[1]，已引起国际医学界的日益重视。作为一种重要的食药兼用的大型真菌，灵芝的现代研究主要集中于液体深层发酵技术以及主要生理活性成分（灵芝多糖、灵芝三萜酸）的研究。而有关灵芝遗传背景的报道甚少，原因可能为高等真菌的分子遗传学研究开展较晚。最早关于丝状真菌的遗传转化始于1973年（Mishra和Tatum对Neurosporacrassa的DNA转化实验），此后关

5、于高等真菌基因工程的研究日益深入。据李刚等人统计，至今已有60多种食用菌的原生质体得到了分离培养[2]。国内外对于灵芝原生质体制备、再生、融合以及遗传转化方面已有多篇报道，为通过基因工程手段定向改良灵芝，进一步发挥灵芝的药用价值奠定了基础。以下将从灵芝原生质体制备、再生的影响因素以及遗传转化的方法等方面来阐述有关灵芝遗传改造的研究进展及应用前景。1灵芝原生质体制备与再生的研究有关食用菌原生质体的大规模研究是近十年的事情，从而为以原生质体为媒介的生物技术提供了极大的可能性[2]。灵芝具有重要的药用价值，其原生质体的研究工作已全面开展，为灵芝的遗传转化研究奠定了基础。高

6、效的原生质体分离和再生系统是遗传转化成败的关键[3]，以下将从材料培养、菌丝预处理、酶解细胞壁、渗透压稳定剂、再生培养等方面来阐述各种因素对灵芝原生质体制备和再生的影响。1.1材料培养一般是将灵芝从PDA斜面保藏培养基接种至液体培养基，液体培养的目的是获取大量分散的健壮菌丝，以利于酶解细胞壁及原生质体的高效收获。菌丝培养时静止培养要优于震荡培养（震荡培养时会形成大量较致密的菌球，不利于与酶的接触，从而使得原生质体制备率下降）；另外可将培养瓶中加入一定量的无菌小玻璃球，通过每日摇打可将菌丝打散，以提高原生质体的制备率[2,4]。根据多篇报道，菌龄的选取以40～48小时

7、为宜[2,5,6]，也有报道将菌龄延长至4～6天[7]。由于不同菌种的生理生化及生长速度不同，因此高效收获原生质体的菌龄亦不相同，一般以对数生长期的幼嫩菌丝酶解制备原生质体效果最好[5]。1.2菌丝预处理预处理的目的主要是清洁、净化菌丝，以利于酶解细胞壁的进行。通过过滤或离心的方法收集菌丝，一般用纯净水和（或）渗透压稳定剂（常用0.4~0.6M的甘露醇）洗涤数次，再次收集菌丝后便可酶解。考虑到灵芝的生理状况较复杂，曹文岑等人的方法[5,6]值得推荐，其中用到0.1M的Tris-EDTA以及0.1M的Tris-EDTA配制的0.2％的巯基乙醇预处理菌丝，可将吸附于