MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞生物学行为的影响.pdf

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1、硕士学位论文MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞生物学行为的影响THEEFFECTOFMEG8-DMRONBIOLOGICALPROPERTIESOFHUH7CELL楚晨哈尔滨工业大学2018年6月国内图书分类号：Q71学校代码：10213国际图书分类号：577.21密级：公开理学硕士学位论文MEG8-DMR对人肝癌Huh7细胞生物学行为的影响硕士研究生：楚晨导师：吴琼教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2018年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q71U.D.C:57

2、7.21DissertationfortheMaster’sDegreeinScienceTHEEFFECTOFMEG8-DMRONBIOLOGICALPROPERTIESOFHUH7CELLCandidate:ChenChuSupervisor:Prof.QiongWuAcademicDegreeAppliedfor:MasterofScienceSpecialty:BiologyAffiliation:SchoolofLifeScience&TechnologyDateofDefence:June,2018Degree-Confe

3、rring-Institution:HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要DLK1-DIO3印记簇位于人类染色体14q32，包含DLK1、RTL1和DIO3这三个父源表达的蛋白质编码基因，和几个大小不一的母源表达的非编码RNA。在这些非编码RNA的基因区间内和内含子中，存在大量的C/DsnoRNAs和microRNAs。父本甲基化的IG-DMR和Gtl2/MEG3-DMR是该印记簇内起主要调控作用的两个差异甲基化区域，先前研究显示这两个DMR区域的亲本特异性敲除会对区间内的基因表达及胚

4、胎发育产生广泛的影响。MEG8-DMR为DLK1-DIO3印记簇内新发现的母本差异甲基化区域，位于MEG8的第二个内含子中。腺病毒载体和SB转座子系统在小鼠Meg8-DMR附近的整合插入效应，导致了上下游基因表达的异常，使小鼠肝癌的发生率增高。这暗示MEG8-DMR可能作为一种重要的DNA调控序列，对上下游基因的表达和原发性肝癌发生存在相应的调控作用。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在人源肝癌Huh7细胞系中敲除MEG8-DMR，研究MEG8-DMR对相关基因的表达变化和Huh7细胞生物学行为的影响。我们构建Cas9-MEG

5、8-DMR重组载体并瞬时转染Huh7细胞，结果显示其可在细胞基因组水平有效敲除MEG8-DMR。敲除MEG8-DMR后在mRNA水平上，DLK1、DIO3、IGF2的表达水平下调；MEG3、MEG8的表达水平无明显变化，MEG9的表达水平上调；同样miR-370的表达水平发生上调。MEG8-DMR的敲除使细胞增殖能力和克隆形成能力减弱，并促进了细胞凋亡；细胞形态、细胞迁移侵袭能力、细胞周期并没有发生显著性变化。综上所述，MEG8-DMR对于相关基因的表达具有调控作用，并以此影响Huh7细胞的生物学行为。这些结果对于进一步探究MEG8-

6、DMR的调控功能和调控机制具有重要意义。关键词：DLK1-DIO3印记簇；MEG8-DMR；Huh7细胞；CRISPR/Cas9-I-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractTheDLK1–DIO3imprintedlocusonhumanchromosome14q32,containsthreeimprintedprotein-codinggenesDLK1,RTL1andDIO3expressedfromthepaternallyinheritedchromosomeandseveralimprintedlargeandsm

7、allnon-codingRNAgenesexpressedfromthematernallyinheritedhomolog,aswellasnumerousC/DsnoRNAsandmicroRNAs.TwomajorelementsinvolvedinregionalimprintingregulationareIG-DMRandGtl2/MEG3-DMR,whicharemethylatedonthepaternal.StudieshasshowndthatknonkouttheseDMRsondifferentlyparen

8、talalleleseffectdgenesexpressionandembryonicdevelopmentintheinterval.MEG8-DMRislocatedinintron2ofMEG8,thenovel