htra1丝氨酸蛋白酶通过xiap途径逆转肝癌细胞多药耐药的相关研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士专业学位论文研究生姓名包万员指导教师姓名朱峰专业名称外科学（普通外科学)研究方向肝癌的化学治疗论文提交日期2015年4月攀苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研宄所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可

2、以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年—月解密后适用本规定。非涉密论文cf日期：政4中文摘要HtrA1丝氨酸蛋白酶通过XIAP途径逆转肝癌细胞多药耐药的相关研究HtrA1丝氨酸蛋白酶通过XIAP途径逆转肝癌细胞多药耐药的相关研究中文摘要目的：对肝细胞癌中HtrA1丝氨酸蛋白酶(HtrA1serineprotease)表达量和肝癌细胞化疗敏感性之间的关系进行研究，同时探讨HtrA1丝氨酸蛋白酶的作用机制。方法：使用阿霉素（adriamycin，ADM）诱导出耐药肝癌细胞株HepG2/ADM，MTT法检测耐药细胞株HepG2/

3、ADM对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）、丝裂霉素（mitomycin，MMC）、奥沙利铂（Oxaliplatin，L-OHP）、阿霉素（adriamycin，ADM）和长春新碱（vincristine，VCR）的化疗敏感性，计算耐药指数（resistanceindex，RI）。Westernblot方法检测HepG2/ADM细胞中HtrA1丝氨酸蛋白酶、多药耐药P糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)以及多药耐药相关蛋白1（multidrugresistance-associatedproteins，MRP1）的表达情况。限制性

4、内切酶BamHI和EcoRI构建真核表达载体pEGFP-N1-HtrA1，然后用pEGFP-N1-HtrA1对肝癌细胞株HepG2/ADM进行转染。MTT检测高表达HtrA1丝氨酸蛋白酶的HepG2/ADM肝癌细胞对5-Fu、ADM、MMC、L-0HP、VCR的化疗敏感性，计算RI，以观察HtrA1丝氨酸蛋白酶的高表达对肝癌细胞耐药的影响，采用加入不同浓度的HtrA1抑制剂NVP-LEB748的HepG2/ADM细胞作为对照。为进一步研究HtrA1丝氨酸蛋白酶的作用机制，通过westernblot检测多药耐药P-gp、MRP1和X连锁凋亡抑制蛋白(X-linke

5、dinhibitorofapoptosisprotein，XIAP)在HtrA1高表达以及分别加入不同浓度NVP-LEB748的HepG2/ADM肝癌细胞中的表达情况，通过XIAPsiRNA抑制其表达后，检测HtrA1高表达的HepG2/ADM细胞对不同化疗药物的化疗耐药的情况，采用活性检测试剂盒对细胞凋亡蛋白酶--天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3、7和9(aspartate-specificcysteineproteases3、7和9,Caspase-3，Caspase-7，Caspase-9)的活性进行分析。结果：成功构建了肝癌耐药细胞株HepG2/ADM，细

6、胞中HtrA1的表达水平明显降低。真核表达载体pEGFP-N1-HtrA1转染HepG2/ADM细胞后，细胞中HtrA1呈明ⅠHtrA1丝氨酸蛋白酶通过XIAP途径逆转肝癌细胞多药耐药的相关研究中文摘要显的高表达状态，HtrA1高表达的HepG2/ADM细胞的化疗敏感性增强，肝癌细胞中HtrA1的表达和耐药指数（Resistanceindex，RI）成负相关。Westernblot发现，不论有无HtrA1抑制剂的存在，P-gp和MRP1的表达水平并没有显著的变化，然而，XIAP的表达却随着HtrA1抑制剂浓度的升高而升高。通过RNA干扰后，XIAP的低表达导致R

7、I的低水平，XIAP的表达和HepG2细胞的化疗敏感性之间为负相关关系，另外，随着抑制剂浓度的增高，caspases3、7和9的活性也明显降低。结论：HtrA1的高表达可以逆转肝癌细胞的多药耐药，其通过XIAP途径来提高肝癌细胞的化疗敏感性，HtrA1可能能够作为肝癌化疗的一个靶点。关键词：HtrA1丝氨酸蛋白酶；肝细胞癌；化疗耐药；化疗敏感性；X连锁凋亡抑制蛋白作者：包万员指导教师：朱峰Ⅱ英文摘要HtrA1丝氨酸蛋白酶通过XIAP途径逆转肝癌细胞多药耐药的相关研究HtrA1resensitizesmultidrug-resistanthepatocellula

8、rcarcinomace