鹅细小病毒的分离鉴定及其致病性和免疫性研究

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1、分类号：S855.3单位代码：10193密级：公开学号：2012627硕士学位论文鹅细小病毒的分离鉴定及其致病性和免疫性研究Isolation,Identification,PathogenicityandImmunityofGooseParvovirus作者姓名：赵健学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：动物病毒学指导教师：胡桂学教授所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大

2、学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论

3、文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要鹅细小病毒病又称小鹅瘟，是由鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)引起的雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性传染病，使雏鹅及雏番鸭发生急性或亚急性败血症，具有传播速度快、死亡率高等特点。该病主要病理变化为渗出性肠炎，以空肠和回肠的急性卡他性-纤维素性坏死性肠炎为特征。发病后耐过的雏鹅及雏番鸭生长发育迟缓，形成

4、“僵鸭”，给养鹅业造成了巨大的经济损失。自1961年方定一发现小鹅瘟病以来，国内外陆续也有本病的报道。由于该病对养鹅业危害严重，国内外很多研究学者对其开展了深入研究。小鹅瘟在吉林省局部地区也呈流行趋势，近几年吉林省的九台、德惠、辽源、白城、磐石、镇赉等多个地区发生小鹅瘟疫情，为了确诊该病及对分离到的病毒进行免疫分析，本研究从患病雏鹅病料中分离并鉴定了6株GPV，分别命名为JLJT、DH、LY、BCH、PSH、ZL株，并对各毒株VP3基因进行了克隆、测序分析，开展了各毒株致病性、免疫原性及交叉保护性的研究，为小鹅瘟疫苗的研制奠定基础。将来自不同地区发病死亡雏鹅的肝脏和栓塞段小肠及其内容物研磨制

5、成匀浆，离心去除沉淀，双抗孵育除去细菌，接种12日龄鹅胚，收集尿囊液；通过PCR鉴定，以及将VP3基因片段纯化后克隆到pMD18-T载体中，进行重组质粒测序。由测序结果再次证明所分离的病毒均为GPV。同时，测定了包括本研究室已经分离鉴定的2株GPV在内的8株GPVVP3基因序列，并进行了基因及氨基酸序列分析。诱导表达了实验室保存的四平株（SP）VP3基因重组质粒pGEX-4T-VP3，经树脂纯化后得到VP3蛋白；提纯鹅卵黄IgY并免疫实验兔，获得抗血清；采用树脂亲和层析方法纯化兔IgG；通过改良的高碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，获得兔抗鹅酶标抗体；通过各条件的优化建立能够检测鹅血清GPV抗

6、体的间接ELISA方法。结果表明，GPV间接ELISA方法VP3蛋白最佳包被浓度为4μg/mL、血清稀释倍数为100倍、酶标抗体稀释倍数为1100倍。本研究通过攻毒实验，观察雏鹅发病及死亡情况；将死亡雏鹅肝脏及小肠制成石蜡切片，综合雏鹅发病死亡情况及病理切片观察结果，证明镇赉株GPV致病性较强。采取死亡雏鹅心血，获得血清，以本研究建立的间接ELISA方法测定并比较各血清中抗GPV抗体水平，结果发现镇赉株接种雏鹅血清抗体OD450nm值最高，为0.684。以镇赉株GPV与弗氏不完全佐剂制成油佐剂灭活苗免疫雏鹅，13d后以8株GPV进行攻毒实验。结果发现，攻毒后15d阴性对照组5只鹅全部死亡，死

7、亡前表现明显的精神沉郁、食欲废绝、腹泻、排白色条状带泡沫的稀粪；剖检发现肝脏充血、出血，脾脏肿大、充血，肾脏肿大、充血出血，脑膜充血、出血；卵黄蒂附近小肠肿大，有长短不等的栓塞，剪开后栓塞呈黄I白色、触摸坚实、呈明显的腊肠样栓塞。LY，CH，ZL，BCH，JLJT，DH株GPV攻毒组雏鹅未出现死亡，保护率达100%(5/5)；PSH组有1只死亡，保护率为80%(4/5)。由此说明，镇赉株GPV致病性、免疫原性