苏云金芽孢杆菌cry5ba3基因的表达及对松材线虫的毒杀效果研究

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1、12ZhejiangA&FUniversityDissertationfortheDegreeofMastertheExpressionofBacillusThuringiensisCry5Ba3andItsLethalEffectonPineWoodNematodeCandidate:LeiMeng‐yingAdviser:ZhangLi‐qin,ProfessorAssociateSupervisor:WangYong‐jun,AssociateProfessorSpeciality:ForestProtectionDateofSubmission:2015,6,1ZhejiangA&FU

2、niversityLin’an,Zhejiangprovince,P.R.ChinaJune,20153摘要松材线虫病（Bursaphelenchusxylophilus）是一种毁灭性的松树病害。cry5Ba3是本实验室从苏云金芽孢杆菌zjfc85上克隆获得的新型毒蛋白基因，其编码的蛋白对松材线虫具有显著的毒杀活性。为了进一步明确cry5Ba3基因编码的杀虫晶体蛋白的功能，本研究构建了经序列优化的cry5Ba3基因的表达质粒，通过农杆菌介导的遗传转化，将cry5Ba3Φ基因整合至灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）的基因组中，通过生测实验，明确了转cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢对松材线虫

3、的毒力。取得以下结果：1.根据丝状真菌密码子的偏好性，对cry5Ba3基因进行全基因改造。调整了567个碱基，使得该基因的密码子在真菌中获得最高翻译效率，改造后的基因命名为cry5Ba3Φ。2.通过体外序列合成的方法，将trpC启动子序列、cry5Ba3基因序列以及trpC终止子序列连接到pUC-57质粒上，获得pUC57-cry5Ba3Φ。通过酶切将其连接到pTFCM质粒，获得根癌农杆菌转化质粒pTFCM-cry5Ba3Φ。3.采用农杆菌介导的遗传转化方法，将含质粒pTFCM-cry5Ba3Φ的根癌农杆菌AGL-1与灰葡萄孢野生型菌株共培养，在含潮霉素的选择培养基上筛选获得5个转化子。PCR

4、验证和Southern杂交试验表明cry5Ba3Φ基因单拷贝整合到灰葡萄孢菌基因组中。稳定性试验表明cry5Ba3Φ基因与潮霉素选择基因一起整合至灰葡萄孢的基因组中，并且稳定遗传。4．qRT-PCR结果表明，在转基因灰葡萄孢菌中cry5Ba3Φ基因的表达量是house-keeping基因actin的5.6±1.1倍。而cry5Ba3Φ基因在野生型灰葡萄孢菌中没有表达。5.生测实验发现用转cry5Ba3Φ基因灰葡萄孢菌饲喂松材线虫，松材线虫的繁殖总量为对照的48%-65%，死亡率为对照的1.7-2.5倍。综上所述，本研究明确了一个新的杀虫晶体蛋白基因cry5Ba3对松材线虫的毒杀活性，构建了在灰

5、葡萄孢菌中高效表达的转基因体系，为苏云金杆菌新型生物农药的开发及应用奠定了理论基础。关键词：苏云金芽孢杆菌，cry5Ba3基因，灰葡萄孢菌，遗传转化，松材线虫4AbstractThepinewoodnematode(Bursaphelenchusxylophilus)isadestructivediseaseforpines.Theinsecticidalcrystalproteinencodedbycry5Ba3,previouslyisolatedfromBacillusthuringiensiszjfc85,hasasignificantlylethaleffectonthenemato

6、deB.xylophilus.Todefinethelethaleffectandthemechanismofcry5Ba3onB.xylophilus,codonoptimizationofthisgenewasexecutedtoenhancetheexpressionofcry5Ba3inBotrytiscinerea.TheexpressionvectorpTFCM-cry5Ba3wasconstructed,andtransformedintoBotrytiscinereausingAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation(ATM

7、T).TheeffectofCry5Ba3onB.xylophiluswasdetermined.Theresultswaslistedasfollowing.1.Thenewcodinggenewasdesigned(567bpwaschanged)toenhancetheexpressioneffectinfungi,andnamedascry5Ba3Φ,accordingtocodonpre