脯氨酰寡肽酶过表达对硫代乙酰胺诱导大鼠肝纤维化模型影响

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1、上海交通大学硕士学位论文脯氨酰寡肽酶过表达对硫代乙酰胺诱导大鼠肝纤维化模型影响作者姓名：王晶指导教师：陈源文副主任医师导师组成员：范建高教授李定国教授徐雷鸣主任医师学科专业：内科学（消化系病）答辩日期：2015年5月学号：1127229316基金项目：国家自然科学基金项目（81170410，81260081）新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目（XJEDU2012I001）上海市卫生和计划生育委员会“优秀青年人才培养计划”项目（XYQ2011010）2015年5月脯氨酰寡肽酶过表达对硫代乙酰胺诱导大鼠肝纤维化模型影响PLOYLOLIGOPEPTIDASEOVEREX

2、PRESSIONATTENUATESTHIOACETAMADE-INDUCEDHEPATICFIBROSISINRATS作者姓名：王晶指导教师：陈源文副主任医师学科专业：内科学（消化系病）研究方向：慢性肝损伤修复与肝纤维化申请学位：硕士学位关键词：肝纤维化；脯氨酰寡肽酶；慢病毒；过表达；硫代乙酰胺基金项目：国家自然科学基金项目（81170410，81260081）新疆维吾尔自治区高校科研计划重点项目（XJEDU2012I001）上海市卫生和计划生育委员会“优秀青年人才培养计划”项目（XYQ2011010）上海交通大学医学院附属新华医院脯氨酰寡肽酶过表达对硫代乙酰胺诱

3、导大鼠肝纤维化模型影响摘要目的：探讨慢病毒介导的脯氨酰寡肽酶（POP）过表达对硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化模型的影响。方法：从基因库中获取大鼠POP基因序列（NM_031324），构建携带POP基因慢病毒过表达载体，通过酶切鉴定及测序的方式鉴定阳性质粒，采用WesternBlot的方法验证POP蛋白在293T细胞内的表达；以不同剂量的POP慢病毒载体（1.25×10^7TU、2.5×10^7TU和5×10^7TU）转染正常大鼠，另设相应浓度空病毒载体对照（每组n=3，门静脉注射病毒)，注射后2w进行肝脏取材，实时定量PCR检测不同剂量慢病毒转染后肝内POPmRNA相

4、对表达量的差异；以慢病毒（5×10^7TU）转染正常大鼠，分别于注射后1w、2w和3w处死大鼠，用实时定量PCR检测转染不同时长肝内POPmRNA相对表达量变化。40只雄性SD大鼠随机分为4组，采用5％TAA腹腔内注射诱导大鼠肝纤维化模型，各组分别在造模第1w末门静脉注射生理盐水（正常对照组和TAA模型组）、空病毒（空病毒组，TAA模型+空病毒组）或携POP慢病毒（POP慢病毒组，TAA模型+POP慢病毒）；在造模第4w末，隔夜禁食后次日下腔静脉取血，处死动物，称量肝脏湿重，留取肝脏组织；采用苏木素-伊红（HE）染色及Masson染色观察肝脏病理形态学及纤维化情况，

5、采用化学比色法测定肝组织内羟脯氨酸含量，采用实时定量PCR检测肝脏组织POP、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、α平滑肌骨动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β（TGF-β）和Ⅰ型胶原（Col-1）mRNA表达，采用WesternBlot法检测POP、CD68、α-SMA、TGF-β、磷酸化Smad-2蛋白表达水平，采用免疫组织化学染色检测CD68(+)细胞数量和分布；采用自动生化仪测定各组大鼠血清生化指标，包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）。结果：酶切鉴定及测序结果均与目的基因吻合，转染293T

6、细胞后，WesternBlot可在293T细胞内检测到Flag与目的基因融合蛋白；不同剂量的携POP慢病毒I或空病毒转染大鼠2w后，与正常对照组比较，大鼠肝组织内POPmRNA表达在1.25×10^7TU慢病毒组RQ值为0.96，与对照组相比无显著差异，2.5×10^7TU慢病毒载体组与5×10^7TU慢病毒载体组RQ值分别为1.38和1.3，均显著高于对照组（P<0.01）,但2.5×10^7TU组与5×10^7TU组之间无统计学差异；空病毒载体与正常对照组间POPmRNA无显著差异。冰冻切片观察荧光与上述结果相符。模型组POP蛋白相对表达量较正常对照组显著降低（

7、P<0.05），而POP慢病毒组POP蛋白水平较其余三组均显著升高(P<0.01)，POPmRNA相对表达变化与POP蛋白相一致；TAA模型组和空病毒组的纤维化评分多为Ⅱ级，肝纤维化半定量积分分别为(15.2±1.69)和（15.3±4.62），显著高于正常对照组(1.75土0.63)和POP慢病毒组(7.75±2.71)（P<0.05）；模型组和空病毒组肝组织羟脯氨酸含量分别为（504.47±111.15）µg/g肝质量和（498.32±90.87）µg/g肝质量，均显著高于正常对照组【（298.20±47.47µg/g肝质量），P<0.05】，而POP慢病毒