滋阴中药活性成分对神经退行性疾病的神经保护作用及机制研究

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1、上海交通大学博士学位论文滋阴中药活性成分对神经退行性疾病的神经保护作用及机制研究博士生：李加梅学号：0127109059指导教师：胡雅儿教授学科专业：影像医学与核医学研究方向：中药活性成分对神经退行性疾病的干预及机制研究申请学位：博士学位培养单位：上海交通大学医学院2015年4月基金资助国家自然科学基金(No.30873056)；科技部综合性新药研究开发技术大平台（NO.2009ZX09301-007）。上海交通大学上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用

2、学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。＿本学位论文属于＂不保密０。＂＂（请在Ｗ上方框内打Ｖ）学位论文作者签名；指导教师签名；＾＾日期：玉年貧月Ｓ日日期：句ｒ年ｒ月广日上海交通大学博士学位论文滋阴中药活性成分对神经退行性疾病的神经保护

3、作用及机制研究摘要阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）和帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是好发于老年人最常见的神经退行性疾病。AD主要病理特征是基底核胆碱能神经元变性丢失，PD则是黑质多巴胺能神经元的退行性变性丢失等。神经营养因子，特别是脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（Glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF）对于神经

4、元的存活、生长发育具有重要作用。开发诱导内源性BDNF/GDNF表达的小分子化合物已成为神经退行性疾病药物治疗的一个研究热点。因此，本课题主要研究滋阴中药活性成分哈巴俄苷（harpagoside，HAR）和异菝葜皂苷元（Smilagenin，SMI）在神经退行性疾病中的作用，探讨是否与诱导BDNF/GDNF蛋白表达有关，从而阐明他们改善神经退行性疾病的共性。第一部分实验，通过构建拟AD模型，从在体和离体两个层面研究HAR对拟AD模型的神经保护作用，并对相关机制进行探讨。在体实验，通过双侧海马立体定

5、位注射Aβ1-40，构建拟AD大鼠模型。喂服HAR60天后，首先进行相关行为学测试，用旷场试验评价大鼠运动功能，新物体识别实验和Y-迷宫实验评价学习记忆功能。行为学分析显示，与假手术对照组相比，Aβ损伤的模型组大鼠学习记忆功能明显下降；HAR治疗能够改善其学习记忆功能；各组大鼠的运动功能没有差异。接着用ELISA和Westernblot方法观察HAR对BDNF及其信号转导通路相关蛋白的影响。结果发现HAR能够上调模型大鼠内嗅皮层、海马组织下降的BDNF蛋白表达，提高其皮层、海马组织p-ERK与ER

6、K、p-AKT与AKT的比值。提示HAR能够诱导BDNFI上海交通大学博士学位论文蛋白表达以及激活ERK、AKT信号转导通路。最后观察HAR对突触蛋白的影响，结果发现突触蛋白含量在各组大鼠皮层、海马组织中均无明显差异。离体实验，采用Aβ1-42损伤原代皮层神经元作为拟AD细胞模型。首先，研究HAR对皮层神经元的保护作用。结果显示HAR预保护24h能剂量依赖性的提高A损伤细胞的存活率（MTT分析），提高ChAT阳性神经元的数目及轴突长度（免疫细胞化学分析）。提示HAR能够保护胆碱能神经元免于Aβ损

7、伤。Westernblot结果显示HAR提高Aβ损伤组p-ERK/ERK、p-AKT/AKT的值。最后，对HAR的机制进行研究。阻断BDNF后，发现HAR提高A损伤细胞存活率的能力以及保护ChAT阳性神经元的作用被全部或者部分抑制，提示HAR发挥保护作用的机制可能是通过上调BDNF蛋白表达实现的。前期研究发现SMI对老年大鼠学习记忆功能有影响，第二部分实验主要研究SMI对老年大鼠多巴胺能神经系统退行性改变和运动功能的影响。以青年和老年大鼠为研究对象，老年大鼠给予灌胃SMI60天后能够显著改善老年

8、大鼠的运动功能（旷场试验和Rotarod行为学测试）、增加黑质致密部酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数目（免疫组织化学染色和立体计数）、提高纹状体多巴胺转运体密度（放射自显影测定）和脑内多巴胺受体（D1、D2R）密度（放射配基结合分析）。同时，SMI能提高老年大鼠下降的GDNF蛋白含量（ELISA）。综上所述，我们首次证实HAR可能通过上调BDNF蛋白表达及激活下游MAPK/PI3K信号转导通路，促进胆碱能神经元的存活及轴突生长，从而改善拟AD模型大鼠的学习记忆功能。本研究还发现SM