铁皮石斛mirna的检测及差异表达研究

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1、硕士学位论文Master’sThesis铁皮石斛miRNA的检测及差异表达研究作者姓名：杨支力指导教师：徐涛教授学科专业：生物学所在学院：生命科学学院提交日期：二零一五年三月中国杭州ZHEJIANGSCI-TECHUNIVERSITYMASTERDISSERTATIONIdentificationanddifferentexpressionofDendrobiumofficinalemiRNAsZhiliYangDirectedbyProfessorTaoXuCollegeofLifeSciences,ZhejiangSci-TechUniversityHA

2、NGZHOU,CHINA分类号：密级：UDC：铁皮石斛miRNA的检测及差异表达研究论文答辩日期2015.03.11答辩委员会主席商晗武论文评阅人答辩委员会成员刘小川许传莲姜永厚丁先锋课题来源自选课题浙江理工大学硕士学位论文铁皮石斛miRNA的检测及差异表达研究摘要MicroRNA(miRNA)是一种长度约为22nt的内源非编码RNA，miRNA能够与靶mRNA互补配对进而切割或抑制靶基因，从而在转录后水平调节基因的表达。成熟的miRNA与AGO蛋白结合形成RISC复合体进而与靶mRNA的非翻译区互补配对最终下调靶基因的表达量。越来越多的研究表明，miRNA

3、参与生长调节、增殖分化以及凋亡等众多生物学过程。随着植物miRNA研究不断推进，已有包括拟南芥、水稻、玉米、大豆等在内的众多植物miRNA被发现和报道。miRBase数据库收入了大量的植物miRNA信息供科研人员查询和研究。然而目前在miRBase数据库中未见有铁皮石斛miRNA被收录。因此，检测铁皮石斛miRNA将成为研究铁皮石斛miRNA的生物学功能的关键。铁皮石斛是多年生单子叶兰科植物，在中国是一种传统名贵中草药材，具有抗氧化、免疫调节、抗疲劳、促消化、降血压以及抗肿瘤等多种药用功效。在自然环境下铁皮石斛存活率很低，再加上近年来过度采挖，野生铁皮石斛资

4、源几近枯竭。目前市场上的铁皮石斛主要来自于人工栽培。在自然环境或人工栽培条件下，铁皮石斛的生长十分缓慢，并且必须与真菌共生才能存活；而在组织培养环境中，铁皮石斛无菌苗中不含有共生菌，但需要在培养基中添加激素才能生长，这表明了培养基中的激素可能对铁皮石斛的生长发育起到关键作用。为检测铁皮石斛中所含有的miRNA以及探索组培和盆栽环境下铁皮石斛miRNA表达差异，我们采用miRNA芯片来检测铁皮石斛的miRNA，结果发现了120个在组培铁皮石斛和盆栽铁皮石斛中均表达的miRNA，它们分别来自于37个miRNA家族。通过与其他植物发现的miRNA相比较，我们发现这

5、些miRNA与水稻及拟南芥等植物的miRNA有着很高的同源性，说明在许多植物中这些miRNA具有较高的进化保守性。基于两组芯片实验信号值，我们筛选出在组培和盆栽铁皮石斛中差异表达的6个miRNA家族的45条miRNA。结果显示，与盆栽铁皮石斛相比，miR156，miR164，miR171，miR529和miR827在组培铁皮石斛中高表达，而miR167在组培铁皮石斛中低表达，这说明了铁皮石斛miRNA可以由不同的种植环境调控。通过靶基因预测以及GO注释，我们发现大多差异表达miRNA参与生长调控、I浙江理工大学硕士学位论文铁皮石斛miRNA的检测及差异表达研

6、究核酸结合以及应激反应等生物学过程。为了验证部分芯片实验的结果，我们筛选出6个具有代表性的miRNA进行荧光定量PCR验证。结果显示，与盆栽铁皮石斛表达的miRNA相比，6条测试的miRNA中，miR156g、miR529b以及miR827a在组培铁皮石斛叶片组织中表达量上调，而miR159d、miR167h以及miR528在组培铁皮石斛叶片组织中表达量下降。其中miR156g、miR529b和miR167h在两组铁皮石斛中表达量差异最高，因此它们可能在组培铁皮石斛的生长发育中起到重要作用。此外，miRNA芯片与qRT-PCR两种方法所产生的表达差异结果数据

7、总体比较吻合，这说明芯片结果能够被qRT-PCR实验所验证。本实验检测了铁皮石斛miRNA并初步筛选了在组织培养和盆栽环境下差异表达的miRNA，为今后研究铁皮石斛miRNA在生物学过程中所行使的功能奠定了基础。关键词：铁皮石斛miRNA；差异表达；靶基因；GO注释；qRT-PCRII浙江理工大学硕士学位论文铁皮石斛miRNA的检测及差异表达研究AbstractMicroRNAs(miRNAs)areendogenous~22ntnoncodingRNAsthathaveimportantfunctionsintheregulationofgeneexpre

8、ssionatpost-transcriptiona