自噬及gef-h1通路对缺血再灌注后神经元损伤的影响及人参皂甙rb1的干预研究

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1、前言脑血管病（cerebrovasculardisease）是指脑血管病变所引起的脑功能障碍性疾病，具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点。缺血性脑血管病在临床更为常见，其发病率约占脑血管病的80%以上，因此是脑血管病防治的重点。虽然目前已经有多种方法改善缺血脑区的血流供应，如颈内动脉内膜剥脱术、颅内外血管搭桥术、血管内支架置入术等，但是“再灌注后脑损伤”一直是影响治疗效果的主要因素之一，也是神经科学研究的重点和难点问题。1982年，日本学者Kirino采用沙鼠全脑缺血再灌注模型发现了“延迟性神经元死亡”的现象。脑缺血结束后沙鼠海马神经元形态未见明显变化，却在再灌注三天后呈现死亡神经元的病理特

2、征。此后，这一现象也在大鼠上得到证实。进一步的研究还证实脑缺血再灌注大鼠的认知能力也受到严重损害，而且这与突触的传递功能受损也有密切关系。目前研究证实缺血再灌注导致的脑损伤是一个复杂的过程，既包括神经元受损、胶质细胞激活、基质改变，还包括血脑屏障通透性增高、突触传递功能下降等。因此，我们将研究目标集中在探讨“缺血再灌注对神经元的影响”上，从保护神经元抵抗缺血再灌注损伤和缺血再灌注后神经元可塑性恢复两方面来进行研究。以往研究表明缺血再灌注性神经元损伤是一个多因素参与的过程，不仅与氧化应激反应、离子紊乱、线粒体功能障碍及炎症反应等有关，还与蛋白质代谢障碍及蛋白聚集物的形成有密切关系。有研究发现，脑

3、血流再灌注过程中，神经元内产生了大量需要被降解的未折叠蛋白（UnfoldedProteins）和错误折叠蛋白（MisfoldingProteins），这些异常蛋白通过暴露在其表面的粘性疏水基团，彼此粘连在一起形成了蛋白聚集物。自噬是细胞内重要的一条蛋白质代谢通路。与蛋白酶体主要负责降解短寿蛋白不同，自噬主要降解细胞内的长寿蛋白和受损的细胞器。在生理状态下，自噬被限定在一个基础代谢范围内；在内外环境的刺激下，自噬被激活以应对环境变化。神经元细胞自噬（Autophagy）可能是在脑缺血损伤后大脑通过移除有毒的蛋白质聚集物和受损的细胞器来修复大脑的重要代谢途径。在肿瘤细胞，自噬的激活增强了肿瘤细胞对

4、放疗和化疗的抵I抗作用。但是，过度激活的自噬可以导致细胞进入程序性死亡途径（自噬性死亡）。在脑缺血再灌注后神经元损伤的过程中，自噬的作用尚不清楚，因此在本研究的第一部分，我们采用体外和体内研究探讨自噬在全脑缺血再灌注所致神经元死亡中的作用及干预方法。此外，神经可塑性关系着神经的再链接和突触的网络修复，这是脑缺血后一个重要的修复机制。以往研究表明，脑缺血发生后，神经突触发生了显著的形态学的改变和分子重组。与神经微管相关联的Rho活化因子GEF-H1是神经轴突网络再连接，树突棘回缩及原始基因表达的重要调节者。RhoA是被广泛研究在中枢神经系统里调控轴突生长和树突棘回缩的Rho-GTP酶，活化的进程

5、包括脱磷酸化和GEF-H1蛋白重新定位在突触细胞膜和细胞核内，并催化了RhoAGTP酶，使GTP转化成GDP，从而调节了细胞骨架的动力。此外，GEF-H1和RhoA通过调节细胞核的细胞骨架网络来调控基因表达。现已证实RhoGTP酶关联的神经微管活化因子GEF-H1是神经轴突网络再修复的重要调节因子，但是GEF-H1通路在脑缺血后的变化及意义尚不清楚，因此在本研究中我们还探讨了脑缺血再灌注后GEF-H1通路的改变。本研究中的主要工作是我在联合培养攻读博士学位期间，在美国马里兰大学的卒中与外伤研究中心实验室完成的，得到了NIH，AHA和国家留学基金委建设高水平大学公派留学项目资助。实验的整个过程得

6、到了实验室全体人员的支持和帮助。II中文摘要自噬及GEF-H1通路对缺血再灌注后神经元损伤的影响及人参皂甙Rb1的干预研究缺血性脑血管病是严重影响人类健康的主要疾病，其发生原因主要是由于血管重度狭窄或堵塞导致的脑组织血液供应不足。目前，临床上多选择颈内动脉内膜剥脱术、血管内支架置入术及颅内外血管搭桥术等方法恢复缺血脑区的血液供应，但是再灌注性脑损伤已经成为影响缺血性脑血管病疗效的主要因素之一。所以，探讨缺血再灌注性脑损伤的发生机制以及防治措施对提高缺血性脑血管病的治疗效果具有积极的意义。在本研究中，我们从“神经元”及“突触联系”两个方面探讨了缺血再灌注性脑损伤的发生机制及潜在的防治措施。主要做

7、了三部分实验，分别研究了自噬对缺血再灌注神经元损伤的影响，以及人参皂甙Rb1的干预作用和机制；人参皂甙Rb1的保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系；以及GEF-H1通路对脑缺血再灌注后神经元可塑性功能恢复的影响。第一部分自噬在缺血再灌注性神经元损伤中的作用及人参皂甙Rb1的干预研究目的：探讨自噬对缺血再灌注神经元损伤的影响及人参皂甙Rb1的干预作用和机制。方法：采用体外研究和体内研究相结合的研