人参皂甙rd抑制脊髓缺血再灌注损伤后神经元的凋亡

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1、人参皂甙Rd抑制脊髓缺血再灌注损伤后神经元的凋亡GinsenosideRdinhibitsneuronalapoptosisfollowingspinalcordischemia/reperfusioninjury作者姓名：王宝刚专业名称：外科学指导教师：朱庆三教授学位类别：医学博士论文答辩日期：2015年06月01日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位王欢教授中国医科大学附属盛京医院主席张学文教授吉林大学中日联谊医院闫景龙主任医师哈尔滨医科大学附属第二医院委员鲍永利教授东北师范大学杨群教授大连医科大学附

2、属第一医院章培标研究员长春应用化学研究所毕郑刚教授哈尔滨医科大学附属第一医院高忠礼教授吉林大学中日联谊医院王金成教授吉林大学第二医院姜金兰教授吉林大学中日联谊医院中文摘要人参皂甙Rd抑制脊髓缺血再灌注损伤后神经元的凋亡在脊髓缺血再灌注损伤造成的迟发性瘫痪中，神经元凋亡是细胞死亡的主要方式，是造成治疗困难、疗效不明显的重要原因之一。ASK1-JNK/P38MAPK途径是调节细胞凋亡的重要信号传导途径，抑制ASK1信号通路可减少细胞凋亡的发生。人参皂甙Rd是人参的主要成份之一，既往实验表明Rd对缺血性脑卒中具有明确的神经保护作用，对于同属中枢神经系统的

3、脊髓组织，Rd是否同样发挥保护作用，至今未见报道。本实验通过建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，观察腹腔注射Rd后大鼠后肢运动功能改善程度、组织病理变化及神经细胞凋亡情况，探讨Rd对脊髓缺血再灌注损伤是否具有神经保护作用，以及这种作用是否与抑制神经细胞凋亡有关，为进一步明确Rd的药理作用及应用于临床治疗提供实验依据。目的：观察人参皂甙Rd对SD大鼠脊髓缺血再灌注损伤后运动功能的改善情况并通过行为学分析、特殊染色、免疫组织化学染色、Westernblot等方法相结合，揭示其可能的分子机制。方法：1、确定最佳治疗剂量随机选择SD大鼠30只，分为假手术组（S

4、ham组）、缺血/再灌注损伤组（I/R组）、6.25mg/kgRd组、12.5mg/kgRd组、25mg/kgRd组、50mg/kgRd组，每组5只；其中6.25mg/kgRd组、12.5mg/kgRd组、25mg/kgRd组、50mg/kgRd组为治疗组。假手术组，仅打开腹腔，不夹闭腹主动脉；I/R组，麻醉后切开大鼠腹腔，用动脉夹阻断肾动脉水平以下腹主动脉60分钟后关腹，建立脊髓缺血/再灌注损伤模型；治疗组，按照I/R组方法造成脊髓缺血/再灌注损伤模型，6.25mg/kgRd组，每只鼠按照6.25mg/kg·d剂量给予人参皂甙Rd腹腔注射；12.

5、5mg/kgRd组，每只鼠按照12.5mg/kg·d剂量给予人参皂甙Rd腹腔注射；25mg/kgRd组，每只鼠按照25mg/kg·d剂量给予人参皂甙RdI腹腔注射；50mg/kgRd组，每只鼠按照50mg/kg·d剂量给予人参皂甙Rd腹腔注射。模型建立后每日观察SD大鼠后肢及尾部运动情况，进行BBB评分。全部30只SD大鼠于术后第5日处死，小心剥离胸13水平以下的脊髓组织，置于10%中性福尔马林液4℃固定24小时，以腰2为中心修块，长度3.0mm，常规石蜡包埋、固定，石蜡切片，苏木精-伊红染色（HE染色），根据实验结果确定最佳治疗剂量。2、确定最佳

6、治疗时间随机选择SD大鼠20只，分为建模后1天组、建模后3天组、建模后5天组、建模后7天组，每组5只；四组均建立脊髓缺血再灌注损伤模型，具体方法同前，术后每日观察SD大鼠下肢及尾部运动情况，进行BBB评分，根据上一步实验结果，各组每日均给予相同剂量（即前一步确定的最佳剂量25mg/kg·d）Rd腹腔注射；分别于建模后不同时间处死各组SD大鼠，取出脊髓组织进行HE染色，方法同上，根据BBB评分及染色结果来确定最佳治疗时间。具体情况为建模后1天组于建模后第1日处死，建模后3天组于建模后第3日处死，建模后5天组于建模后第5日处死；建模后7天组于建模后第7

7、日处死。3、大鼠脊髓切片的尼氏染色和Caspase3染色尼氏染色法：石蜡切片常规脱蜡，0.25%的甲苯胺蓝50℃3小时，脱色，脱水，透明，中性树胶封片。采用OLYMPUSBX53显微镜(Olympus)观察，并用CellSensDimension摄像系统(Olympus)显微摄影。所得图片采用Image-ProPlus6.0软件进行图像分析，并测得其灰度值。Caspase3染色方法：石蜡切片脱蜡和水化后，过氧化酶阻断溶液孵育，正常非免疫动物血清孵育后，每张切片加50μl羊抗鼠Caspase3抗体（稀释度1：250）孵育60min，生物素标记的抗羊免

8、疫球蛋白试剂（试剂盒自带）孵育，链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液孵育，新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察，苏木素复染，返蓝；