旋毛虫谷胱甘肽s-转移酶的克隆表达及鉴定

《旋毛虫谷胱甘肽s-转移酶的克隆表达及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码10459学号或申请号201212161842密级公开硕士学位论文旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶的克隆表达及鉴定作者姓名：李灵鸽导师姓名：崔晶教授学科门类：理学专业名称：细胞生物学培养院系：生命科学学院完成时间：2015年4月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterMolecularCloning,ExpressionandCharacterizationofaglutathioneS-transferaseTsGSTGenefromTrichi

2、nellaspiralisByLinggeLiSupervisor:Prof.JingCuiCellBiologyDepartmentofBioengineeringApril,2015学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的此硕士学位论文，是在导师的指导下，独兄进行科学研究所取得的成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含有任何其他个人或集体己发表或撰写过的科研成果。对本论文的研究作出贡献的个人和集体，均己在文中标明。声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：曰肌7^1^-]°日学位论文使用授权声明本学生在导师指导下完成

3、的论文及相关的科研作品，知识产权都归属郑州大学。根据郑州大学有关保存和使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门和机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者-曰期：年月>曰本研究受国家自然科学基金项目（No.81271860and814719

4、81)资助。ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81271860and81471981)摘要旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶的克隆表达及鉴定硕士研究生李灵鸽导师崔晶教授郑州大学基础医学院寄生虫学教研室（郑州450052）河南省分子医学重点学科开放实验室（郑州450052）摘要谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）是一种具有解毒功能的酶，对各种有害的外源性化合物（如致癌物质和诱变剂）与细胞内

5、源性化合物（如脂质过氧化合物）均有分解功能。GST在寄生虫的抗氧化系统中发挥着重要的作用，它可以除去大部分的外源性和内源性的亲电子化合物，有助于寄生虫在宿主内的生存。GST蛋白酶在一些寄生虫中已被鉴定并有所研究，如犬恶丝虫、马来丝虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、肝片吸虫及猪带绦虫等，但关于旋毛虫GST的研究目前尚未见报道。本研究利用生物信息学分析了TsGST与其它寄生虫及模式生物GST的进化关系，应用分子克隆基因技术表达并纯化了一种旋毛虫谷胱甘肽转移酶TsGST，获得rTsGST蛋白及其免疫血清。通过SDS-PAGE和Wes

6、ternblot分析了该重组蛋白的抗原性及免疫原性，RT-PCR、Westernblot及免疫荧光试验（IFA）鉴定了TsGST基因在旋毛虫不同发育虫期的转录、表达及其在虫体的定位；观察了rTsGST免疫小鼠后的抗体应答类型及对宿主的免疫保护作用、免疫血清对旋毛虫侵入肠上皮细胞（IEC）的影响及免疫血清介导的巨噬细胞对旋毛虫的杀伤作用（ADCC）。运用生物化学方法分析了rTsGST的酶活性及其最佳反应条件。本研究鉴定了rTsGST的性质及其功能，为阐明旋毛虫的侵入、生存及其与宿主小肠上皮细胞的相互作用和致病机制奠定基础。

7、I摘要材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞系旋毛虫（Trichinellaspiralis）由郑州大学基础医学院寄生虫教研室昆明小鼠传代保种。BALB/c小鼠、4-6周龄，购自河南省实验动物中心。所用细胞系为小鼠肠上皮细胞（intestinalepithelialcells，IEC），是由本教研室分离培养。2.rTsGST的免疫学分析将rTsGST免疫BALB/c小鼠，获得rTsGST免疫血清，应用旋毛虫感染小鼠血清及rTsGST通过ELISA及Westernblot鉴定rTsGST的抗原性。3.TsGST基因的转录

8、、表达及定位收集旋毛虫的感染性幼虫、成虫、新生幼虫及肌幼虫，提取总RNA进行RT-PCR，扩增TsGST基因及内参基因GAPDH，检测TsGST基因的表达时相。收集小鼠感染旋毛虫后3d与7d的成虫，新生幼虫及肌幼虫，制备可溶性抗原进行Westernblot，用rTsGST免疫血清对不同虫期的可溶性抗原进行识别，检测T