谷胱甘肽-s-转移酶抑制剂设计、合成及筛选

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1、重庆医科大学硕士学位论文谷胱甘肽--S--转移酶抑制剂设计、合成及筛选姓名：张灵申请学位级别：硕士专业：药物化学指导教师：杨晓兰201205重庆医科大学硕士研究生学位论文谷胱甘肽．s-转移酶抑制剂设计、合成及筛选摘要谷胱甘肽．S．转移酶(glutathione．S．transferases，GST)主要存在于哺乳动物体内，是由相同亚基构成的二聚体；每个亚基有一个活性中心，包含谷胱甘肽结合位点(G．site)和相邻疏水底物结合位点(H．site)。GST抑制剂可增强细胞毒性药物抗肿瘤疗效或直接抑制肿瘤生长，因此，GST抑制剂的设计与筛选成为研究的重点。本文提取制备猪肝酸。I'生G

2、ST同工酶，建立酶促动力学测定GST抑制剂抑制能力方法，同时设计合成一系列GST抑制剂并进行了筛选。1猪肝酸性GST同工酶制备及表征从猪肝经阴离子交换层析和亲和层析制备GST酸性同工酶，此GST被纯化146倍以上，活性总收率近30％。该GST对GSH和CDNB的‰分别为42btmol／L和O．86mmol／L，属于随机双底物动力学模型。2谷胱甘肽．S．转移酶酶促动力学测定其抑制剂抑制能力的方法用还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)和1一氯一2,4-二硝基苯(1-chloro．2，4．dinitrobenzene，CDNB)合成m-(2，4-二硝基苯基)一谷胱甘肽(G

3、S．DNB)为候选抑制剂，以GSH与CDNB为底物测定GST在GS．DNB作用下的米氏常数(‰)和最大反应速度(％)，从而确定GS—DNB对GST的抑制常数(墨)。GS．DNB对CDNB竞争性厨为(21士1)肛rnol／L(刀=2)；对GSH竞争性膨为(17土1)lamol／L∽=2)。产物GS—DNB是GST的高亲和力竞争性抑制剂；测定GST动力学参数随抑制剂浓度的变化可筛选其抑制剂。3谷胱甘肽．S．转移酶抑制剂的设计与筛选通过对参考文献以及脂水分配系数(LogP)等相关化学性质进行考1重庆医科大学硕士研究生学位论文查，主要从两条途径对GST抑制剂进行设计：一、参照GS．DN

4、B的设计思路，针对G．位点和H．site双位点设计产物型抑制剂I，即以对氨基苯甲酸作为原料衍生的一疏水化合物与GSH的加合物；二、针对H．site可结合基团设计较大体积疏水抑制剂，用依他尼酸(ethacrvnicacid，EA)，4．丁基苯甲酸，3，5．二甲基苯甲酸，丹磺酰氯等羧酸作为功能基，1，3．丙二胺、1，5．戊二胺、赖氨酸和1,4．丁二胺作为连接臂，得到对称双酰胺类疏水型抑制剂II。通过酶促动力学初速度法测定合成的GST抑制剂挺进行筛选。结果发现：1)大体积的II类抑制剂比I类抑制剂抑制能力强；2)II类抑制剂中N，N’．双依他尼酰．1，4．丁二胺和N，N’．双对丁基苯

5、甲酰．1，4．丁二胺都为GST相对GSH的强竞争性抑制，抑制常数分别为38nmol／L和0．28Itmol／L。可见，将低亲和力GST抑制剂用柔性短链连成对称结构，有望获得高亲和力GST抑制剂。总之，建立了通过酶促动力学筛选GST抑制剂的方法，通过设计合成并筛选，发现较高的亲和力新型抑制剂，这为发现新的GST抑制剂作为抗肿瘤药物增敏剂奠定基础。关键词：谷胱甘肽．S．转移酶；酶促动力学；抑制剂；抑制常数4重庆医科大学硕士研究生学位论文一DESIGN，SYNTHESISANDSCREENINGOFGlutathione-S-transferase(glutathione—S-tra

6、nsferases，GST)asagroupproteinwithavarietyofbiologicalfunctionswidelyexistinmammals，Itfeaturesasadimeroftwocomposedofidenticalsubunits；eachsub-basehasanactivitycenter,composedofglutathionebindingsite(G-site)andadjacentsparseunderwaterobjectsbindingsites(H-site)．GSTinhibitorsmayenhancetheantit

7、umorefficacyofcytotoxicdrugsordirectlyinhibittumorgrowth．Therefore，thedesignandscreeningofGSTinhibitorsbecomethefocusofthestudy．ThispaperformulatedtheenzymekineticsmethodforthedeterminationinhibitioncapacityofGSTinhibitors，screenedtwoseriesofGSTinh