慢病毒介导的mir-505在下丘脑过表达对小鼠性发育的影响

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1、东华大学硕士学位论文慢病毒介导的miR-505在下丘脑过表达对小鼠性发育的影响专业名称：生物化工作者姓名：常雪莹指导老师：周宇荀学校代码：10255学号：2120449东华大学硕士学位论文慢病毒介导的miR-505在下丘脑过表达对小鼠性发育的影响TheinfluenceofhypothalamicmiR-505OverexpressiononthepubertyonsetinMice学科专业：生物化工作者姓名：常雪莹指导教师：周宇荀答辩日期：2015年1月15日东华大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在

2、导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2015年1月17日东华大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年

3、解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密√。学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2015年1月17日日期：2015年1月17日慢病毒介导的miR-505过表达对小鼠性发育的影响慢病毒介导的miR-505在下丘脑过表达对小鼠性发育的影响摘要目的：miRNAs（MicroRNAs）是一类具有调控功能的、内源性的天然非编码小RNA，其大小约为20—25个核苷酸；随着研究技术手段的提高和研究内容的深入，越来越多的研究结果表明：miRNAs可以调控大多数蛋白质编码基因的表达，以及参与大量生物过程的调节。许多人类疾病的发生，往往伴随着各种miRNAs非正常水平的表达。目前，m

4、iRNAs被普遍认为是具有生物学意义的潜在生物靶标、疾病调节器，并可以成为疾病治疗药物的靶点。我们的前期遗传学研究结果提示，位于小鼠X染色体：57647578-57647667处的miR-505，可能参与了小鼠性发育启动的调控，但对其生物学功能的研究才刚刚起步。迄今为止的研究表明，miR-505可以通过诱导凋亡抑制细胞的增殖，其唯一被验证的靶蛋白ASF/SF2参与了mTOR信号通路的调控。为了进一步验证miR-505与性发育的关系及解析其可能的机制，本课题使用慢病毒定点注射的方法构建在下丘脑中过表达miR-505的小鼠模型，并通过该模型研究miR-505过表达对雌鼠

5、性发育各种表型的影响，探讨miR-505与性发育启动的关系。方法：利用本室构建的过表达miR-505慢病毒载体，包装得到表达miR–505的慢病毒颗粒，将出生15天的C57/BL6J雌性小鼠在脑立体定位仪进行下丘脑定位，将（1µl）的慢病毒注射到下丘脑中，构建miR-505在下丘脑中过表达小鼠模型，注射后每隔5天取脑制作冰冻切片，采用原位杂交和实时荧光定量PCR的方法，进行miR-505检测和示踪，以确认模型的构建成功。利用该模型观察和记录小鼠的性发育表型：包括体重增长、阴门开启时间、子鼠出生数量、流产率等；处死小鼠后，收集血清，用酶联免疫吸附测定小鼠血清中LH（促

6、黄体生成素）、GnRH（促性腺激素释放激素）浓度；制作卵巢切片，观察并统计卵巢中卵泡的组织学形态与各级卵泡的数量；制作脑冰冻切片，用原位杂交ISH（insituhybridization）方法对不同表型的小鼠下丘脑中miR–505的表达部位及数量进行示踪；结果：实验结果显示在注射部位的小鼠下丘脑区域，miR-505表达量较对照组有明显提高，表明用该方法成功构建了miR-505在下丘脑中过表达的小鼠模型；与对照小鼠相比，模型小鼠体重增长缓慢，并且每日平均体重轻2-3g；阴门开启时间36.67±0.7993天，较对照组推迟3天；从合笼后到子鼠出生时间I慢病毒介导的miR

7、-505过表达对小鼠性发育的影响25.83±1.144天，较对照组延长3天；且流产率提高12%，并有8%的不育；模型小鼠生育后，子代数量减少、死亡率提高；卵巢切片的结果显示，模型小鼠卵巢中黄体出现时间推迟、数量也少于对照组；模型小鼠血清中LH（促黄体生成激素）含量低于对照组，GnRH（促性腺激素释放激素）含量出现不规律波动；脑切片中原位杂交的结果显示miR-505过表达部位对表型有影响。结论：利用慢病毒注射未成年小鼠下丘脑脑区的方法，成功构建了下丘脑中过表达miR-505的模型；使用锁核酸标记探针与酪酰胺信号放大系统的原位杂交方法检测miRNA表达规律较稳定，且