慢病毒介导GFP转染小鼠ESC及其对干细胞特性的影响.pdf

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1、中国实用医药2015年4月第l0卷第1l期ChinaPraeMed，Apr2q_l5，Vo1．Q．11·3·慢病毒介导GFP转染小鼠ESC及其对干细胞特性的影响张爱霞【摘要】目的研究用慢病毒载体进行基因转染对小鼠胚胎干细胞(ESC)特性的影响。方法慢病毒载体经293FT细胞包装后转染小鼠ESC，荧光显微镜下挑选和观察所得阳性克隆，检测ESC特异性标志物Oct一4、SSEA一1的表达，通过拟胚体(EB)诱导体外分化，RT—PCR检测三胚层的分化。结果形态学观察可见所得绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞呈克隆样鸟巢状生长，免疫组化可见GFP—ESC表达

2、ESC特异性标志Oct一4、SSEA一1，能形成EB，RT—PCR检测到甲胎蛋白(AFP)、巢蛋白(Nestin)和血管内皮生长因子受体(Flk—l的表达。结论慢病毒载体介导的基因转染不影响小鼠ESC的自我更新特性及多向分化潜能。’【关键词】胚胎干细胞；慢病毒载体；基因转染；绿色荧光蛋白DOI：10．14163~．cnki．11-5547／r．2015．11．002LentiviralmediatedGFPintransfectionofmiceESCanditsinfluenceonstemcellfeaturesZHANGAi-xia．Sc

3、hoolofBioscience，flayingCollege，Meizhou514015,China【Abstract】ObjectiveTostudytheinfluenceofgenetransfectionbylentiviralvectoronmiceembryonicstemcellfESC1features．MethodsTransfectionofmiceESCwasmadebylentiviralvectorafter293FTcellpacking．Pcsitiveclonewaschosenandobservedunder

4、fluorescencemicroscope．Expressionsof0ct-4andSSEA—lasESCspecificmarkel'sweredetected．InvitrodifferentiationwasinducedbyemhryoidbodyfEB)，andRT—PCRwasappliedtodetectdifferentiationoftriplohlastica．ResultsGreenfluorescentprotein(GFP)positivecellshowedcolonbird—nestgrowthbymorpho

5、logicalobservation．ImmunohistochemistryshowedOct一4andSSEA一1asESCspecificmarkerscouldformEB．Expressionsofalphafetoprotein(AFP)，nestinandvascularendothelialgrowthfactorreceptor(Flk-1)couldbedetectedbyRT-PCR．ConclusionGenetransfectionmediatedbylentiviralvectorhasnoinfluenceonse

6、lf-renewalfeatureandmulti—directionaldiferentiationpotencyofmiceESC．【Keywords】Embryonicstemcell；Lentiviralvector；Genetransfection；Greenfluorescentprotein胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESC)是从附植前早期公司；二抗购于美国R＆D公司；明胶购于美国Sigma公司。胚胎内细胞团或早期胎儿原始生殖细胞经体外分离培养而来1．2ESC与293FT细胞的体外培养ESC的培养用含10％的

7、多能性细胞系。ESC因能够无限增殖并保持未分化状态和胎牛血清、1mmol／LL一谷氨酰胺、0．1mmol／L非必需氨基酸、具有向3个胚层细胞分化的潜力，在研究胚胎发育关键基因0．1mmol／LB一巯基乙醇、1000u，mlLIF的高糖DMEM完全功能、建立疾病模型等方面有着其他细胞无法比拟的优势。培养液，接种到2％明胶包被的培养皿中，37℃、5％CO，的转基因研究是更有效利用ESC进行各种基因功能研究以及培养箱中培养。293FT细胞用含10％胎牛血清、0．1mmol／L基因治疗等的重要手段。研究表明，自身失活的慢病毒载体非必需氨基酸、500I．

8、tg／mlG418的高糖DMEM完全培养液培(1entivirusvectors，LV)是安全而且有效的转基因载体¨’。本养，细胞融合达80％一90％