年龄因素对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

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1、京诚和皆ｆ從中固聲３刮３據博＋研究生学位论文義化京协和隆学院研究生院中国医学科学院北京协和医学院博壬研究生学位论文学校代码：１００２３学号；Ｂ２０１３００４００７博±学位论文年龄因素对人脂肪巧充质干细胞生物学特性的影响Ａｅｒｅｔａｒｄｅｆｆｅｃｔｓｏｎｇｂｉｏｌｏｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｈｕｍａｎｇａｄ－ｉｐｏｓｅｄｅｒｉｖｅｄｓ化ｍｃｅｌｌｓ所院：整形外科医院姓名：刘美辰指导教师；曹谊林ｉ导师小姐：肖巧；马继光；，ｊ霞学科专业：整形外科学（专业型）研究方向：干细

2、胞基础与应用完成日期；２０１５年４月１０日中国医学科学院北京协和医学院博±研巧生学位论文目录中文摘要１英文摘要４论文正文９引胃９材料与方法１１结果２７職４１结５２参考文献５３文献综述６０英文缩略词７０致谢７２独创性声明７３学位论文版权使用授权书７３中国医学科学院北京协和医学院博±研究生学位论文中文搞要研巧背景脂肪间充质干细胞ＡｄｉｏｓｅＤｅｒｉｖｅｄＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ是从脂肪组织中提取的（ｐ）一种具有富度自我更新和多向分化潜能的多能干细

3、胞，可Ｗ参与多种组织器官的再生修复，因其来源充足，取材方便等优势，具有良好的临床应用前景。目前，自体ＡＤＳＣｓ己在临床用于软沮织缺损修复，其在治疗也肌缺血和神经退巧性病变的应用也进入了临床试验阶段。ＡＤＳＣｓ的生物学特性是影响干细胞治疗成败的关键因素之一。随年龄增加，细胞发生自然老化且已有研巧证实年龄因素会影响机体多种，而干细胞的生物学功能。那么，ＡＤＳＣｓ是否随供者年龄增加而发生老化，从而导致其増殖、分化、迁移等生物学特性改变而最终影响修复功能还缺乏深入研究。研巧目的＇明确不同年龄段人脂肪姐织中间充质干细胞含量和老化程度的差异，及其表现在増

4、殖、分化、迁移等生物学特性上的改变，为深入了解年龄因素对干细胞特性的影响及机制提供更丰富的信息，为不同年龄人群自体ＡＤＳＣｓ的临床应用提供有效参考。研巧內容及方法从临床获取２４例人右肋缘皮下切取脂肪组织，按供者年龄分布情况，分为Ｈ组：Ａ－－（）儿童姐，年龄跨度６１２岁；（巧青年组，年龄跨度２２２７岁；（Ｃ）老年姐，年龄跨度６０－７３岁ｓ至第Ｈ代Ｐ３。通过酶消化法获得ｈＡＤＳＣ，扩增用于实验检测。采用（）Ｏｎｅ－ＡＮＯＶＡ及Ｔｕｋｅ定量资料的两两比较分析ｗａ。具ｙｙ检验对实验结果进行多组体研巧内容包括：１．单位体积脂肪ＳＶＦ含量及ｈＡＤＳＣｓ

5、纯度检测ｒｏｍａａｓｃｕ胶原酶消化法获得脂肪组织中有核细胞作为基质血管成分（ＳｔｌＶｌａｒＦｒａｃｔｉｏｎ，ＳＶ巧，比较Ｈ组单位体积脂肪中的ＳＶＦ含量差别；ＳＶＦ贴壁培养获得ｈＡＤＳＣｓ，流式分析Ｐ３代ｈＡＤＳＣｓ干细胞表面标志物表达情况，比较Ｈ组符合干细胞表面标志表达要求的ｈＡＤＳＣｓ比例。２．细胞老化程度及相关机制检测－－Ｇ通过ＳＡＰａｌ染色对各年龄组Ｐ５代ｈＡＤＳＣｓ老化程度进行评价；利用ＭＴＭｉｔｏＳＯＸ巧光染色检测活细胞线粒体超氧化物含量；采用流式分析法检测ｈＡＤＳＣｓ过Ｒｅａ－氧亚硝酸含量ｌｔｉｍｅＰＣ民ｈＡＤＳＣｓｈＴＥＲＴ、

6、；利用检测端粒酶逆转录酶１中国医学科学院北京协和医学院博±研巧生学位论文组蛋白去乙醜化酶ＳＩＲＴ１表达水平，探索不同年龄姐ｈＡＤＳＣｓ出现老化程度差异的机制。３．细胞増殖及调ｔ：检测ＭＴＳ法检测各年龄组ｈＡＤＳＣｓ增殖能力，并通过细胞周期分析及周期调控基因检测探索其机制；利用Ｍｕｓｅ细胞状态分析仪对细胞调ｔ状态进行检测。４．细胞成脂成骨分化能力检测Ｐ－３代ｈＡＤＳＣｓ分别成脂成骨诱导培养，在不同时间点通过沮化染色及ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣ民检测成脂成骨分化关键表型标志基因表达，明确不同年龄组ｈＡＤＳＣｓ的多向分化能力的差异。５．细胞迂

7、移能力及其机制检测利用划线法检测无外源因子作用时ｈＡＤＳＣｓ迁移能力；利用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法检测趋化因子作用下ｈＡＤＳＣｓ的迁移能力。比较各年龄组ｈＡＤＳＣｓ迁移能力的差异，并通过检测各年龄组ｈＡＤＳＣｓ趋化因子受体ＣＸＣＲ４和ＣＸＣＲ７的琴达水平探讨其机制。研巧结果ｓ４１．各年龄组单位体积脂肪ＳＶＦ含量分别为：Ａ组７．２８ｘｌ〇±５．５２ｘｌ〇个／ｍｌ、Ｂ组５４５４ｘｘｘ〇６．３２１〇±４．５１１〇个／ｍｌ、Ｃ组５．５３ｘ１〇±９．８８１〇个／ｍｌ，细胞存活率