GnT-IVa影响癌细胞增殖机制的初步研究.pdf

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1、硕士学位论文GnT-IVa影响癌细胞增殖机制的初步研究PRELIMINARYSTUDYONTHEEFFECTOFGnT-IVaONTHEMECHANISMOFCANCERCELLPROLIFERATION岳伟峰哈尔滨工业大学2018年6月国内图书分类号：Q71学校代码：10213国际图书分类号：577.21密级：公开理学硕士学位论文GnT-IVa影响癌细胞增殖机制的初步研究硕士研究生：岳伟峰导师：聂桓教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2018年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q7U

2、.D.C:577.21DissertationfortheMasterDegreeinSciencePRELIMINARYSTUDYONTHEEFFECTOFGnT-IVaONTHEMECHANISMOFCANCERCELLPROLIFERATIONCandidate：YueWeifengSupervisor：Prof.NieHuanAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeScience&TechnologyDateofDefe

3、nce：June,2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要癌症作为全球主要的公共健康问题，已经成为第二大致死性疾病。而癌症的高发生、高致死率与癌细胞的增殖分化异常及浸润转移能力增强密切相关。大量研究表明，糖基化修饰异常会改变细胞的生物学特征。已有报道证实糖基转移酶IVa（GnT-IVa）和糖基转移酶V（GnT-V）的表达异常都能够影响癌细胞的上皮间质样转化（EMT），GnT-V过表达可以促进肿瘤的生长。但关于GnT-IVa能够调节肿瘤发

4、生及细胞分化的报道较少。在课题组前期的研究工作中，我们发现几种常见的癌症，比如肝癌，绒毛膜癌及宫颈癌中GnT-IVa在癌组织中的表达量比癌旁组织高，且初步的裸鼠成瘤实验表明过表达GnT-IVa的确可以促进肿瘤的形成。因此，为了初步探索GnT-IVa对癌细胞增殖影响的机制，我们主要利用MTT、克隆形成、流式细胞术、qRT-PCR、WesternBlot、co-IP及LC-MS/MS等技术手段对细胞增殖形态、细胞周期分布及相关信号分子的改变三个方面进行了研究。本实验中，我们选取了实验室已有的细胞系模型：内源低表达GnT-IVa的AV3细胞及其GnT-IV

5、a稳转株AV3/GnT-IVa和内源高表达GnT-IVa的HepG2细胞进行相关实验。结果显示，将GnT-IVa过表达后，AV3细胞的增殖能力明显提高。利用靶向GnT-IVa的siRNA对过表达或高表达GnT-IVa的细胞系进行干扰沉默，细胞的增殖能力下降，且增殖相关分子Ki67的mRNA表达下调。这初步说明GnT-IVa能够促进癌细胞增殖。进而我们利用流式细胞仪检测了AV3，AV3/GnT-IVa,AV3/si-NC,AV3/si-GnT-IVa,HepG2,HepG2/si-NC和HepG2/si-GnT-IVa这几种细胞的凋亡率及细胞周期。初步

6、发现GnT-IVa是通过促进癌细胞G1/S期的进程来提高增殖能力，而对凋亡没有明显的影响。随后利用实时定量PCR和蛋白质免疫印记技术分别检测了周期相关分子CyclinD1和CyclinD2，发现糖基转移酶IVa能够促进这两种周期蛋白的表达水平。为了进一步探明GnT-IVa参与调控细胞周期的中间分子，我们借助LC-MS/MS对凝集素DSL免疫沉淀下来的AV3,AV3/GnT-IVa和AV3/si-GnT-IVa蛋白样品进行定性分析，发现含有N-糖链的膜蛋白Integrinβ1存在变化。利用qRT-PCR和WesternBlot技术检测发现Integri

7、nβ1的表达受GnT-IVa正向调控。利用已有的抗体对Integrinβ1免疫沉淀后进行凝集素Blot，发现Integrinβ1的β1,4糖链也明显增多。另外，利用靶向Integrinβ1的siRNA在AV3/GnT-IVa和HepG2中进行沉默干扰后，流式细胞仪检测结果显示G1/S期受到阻滞。我们进一步利用qRT-PCR,WesternBlot分析了Integrinβ1/FAK增殖通路中的几个关键信号分子p-ERK和c-Myc的表-I-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文达情况。结果发现这两个分子均与GnT-IVa表达成正相关。因此，我们初步得出结论Gn

8、T-IVa可能通过糖基化Integrinβ1，从而调控了Integrinβ1参与的细胞增殖通路。综上所得，G