中国美利奴羊ola-dqb1基因exon2的多态性及单倍型与布病易感性的关联研究

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1、分类号：密级：学号：2012103054单位代码：10759石河子大学硕士学位论文中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2的多态性及单倍型与布病易感性的关联研究学位申请人王文文指导教师高剑峰（教授）申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称生物化学与分子生物学研究方向动物功能基因组与分子免疫学所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2015年6月摘要目的：本研究通过对患病和正常的中国美利奴羊不同个体的OLA-DQB1基因exon2基因进行单核苷酸多态性（SNPs）检测，并用Haploview4.2软件构建其单倍型模块，从而分析该基因SNP位点与布鲁氏菌病易感性的关联性，初步筛选与布病

2、易感性相关的单倍型。本研究的目的通过借鉴人类在疾病与HLA-DQB1多态性关系研究中的经验，应用在OLA-DQB1基因SNPs与绵羊相关疾病的关联性分析上，可为绵羊抗病选育以及进一步研究MHC的抗病机理打下基础，为今后开展布鲁氏菌抗性分子标记辅助选择研究提供一定参考依据，通过定位具有易感性的遗传位点从而加快分子遗传抗病育种的进程。方法：1、本研究运用虎红平板凝集试验对408只中国美利奴羊进行羊种布鲁氏菌阴阳性血清检测，之后采用PCR-SSCP技术检测OLA-DQB1基因exon2的SNP位点，选取不同等位基因进行克隆测序，测序结果使用分子生物学软件进行比对分析，将检测到的SNPs

3、及单氨基酸多态性(SAPs)分别与人的进行比较分析，再用PopGene1.32软件对每个SNP位点的等位基因频率和基因型频率进行差异统计分析，从而分析其与布鲁氏菌病易感性的相关性。2、挑选出44个布鲁氏菌阳性和阴性的中国美利奴羊个体，采用PCR产物直接测序法对OLA-DQB1基因exon2的SNPs进行检测，分析其Hardy-Weinberg是否达到平衡，并对筛选的SNPs做连锁不平衡分析，而后使用Haploview4.2和PHASE2.1对符合筛选条件的SNPs构建单倍型连锁图谱并推测可能存在的单倍型，与布病易感性进行关联分析，初步推测与布病易感性相关的单倍型。结果：1、利用虎

4、红平板凝集试验检测羊种布鲁氏菌感染的阴阳性，在408个中国美利奴羊个体中检出332个布鲁氏菌感染阴性个体，其余的76个为阳性个体，布鲁氏菌感染阳性检出率为18.63%。2、在中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2(270bp)的序列内共检测到43个SNPs，其中不存在插入和缺失位点，这些位点中包括41个简约信息位点和2个非信息位点，而二态性的多态位点多达35个。对其相应的氨基酸（89aa）序列进行分析，共发现了29个氨基酸多态位点，且所有突变均为有义突变。3、对HLA-DQB1基因exon2的多态性进行比对分析，结果共发现了56个SNPs和34个有义SAPs。与中国美利奴羊的

5、遗传变异位点相比，人类的SNPs和SAPs更为丰富，其中有7个SNPs位点和碱基变化均与中国美利奴羊的相同。4、在43个SNPs位点中，196G/A位点的等位基因在病例-正常样本中的分布存在极显著差异(P<0.01)，其临近的211C/T变异位点的等位基因频率也具有显著差异（P<0.05）。针对所有检测的SNP位点的基因型进行关联分析，发现196G/A这个变异位点的基因型频率在病例组和正常组中的分布存在显著差异（P<0.05）。I5、根据连锁不平衡和单倍型软件的界面提示，设置SNPs的筛选条件用于构建连锁不平衡图谱和单倍型，从检出的多态位点中共筛选出20个符合条件的SNPs。经连

6、锁不平衡分析发现中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2存在6个LDBlocks，且每个Block中的SNPs之间存在强连锁不平衡，将其依次命名为Block1-Block6。从连锁不平衡图谱可以看出，每个LDBlock内的SNPs位点数不尽相同。6、经单倍型推测，由单倍型软件筛选到的20个SNPs位点共构建了6种单倍型，根据这些单倍型在病例组和对照组中的分布差异，发现Hap5这种单倍型在病例组和对照组中存在显著差异，具有有统计学意义(P<0.05)。结论：1、分析中国美利奴羊OLA-DQB1基因的多态位点，在其exon2全长270bp内共检测到41简约信息位点和29个氨基酸多态

7、位点，说明该序列的确存在丰富的SNPs和SAPs，这与免疫基因编码产物的多样性相一致。2、由于绵羊与人的OLA-DQB1基因序列具有高度的同源性，因而对HLA-DQB1基因exon2的多态性进行分析，比对结果表明人类HLA-DQB1基因exon2的SNPs和SAPs均比中国美利奴羊的要丰富复杂许多。3、将中国美利奴羊OLA-DQB1基因exon2检出的SNPs与布病易感性进行关联分析，结果表明196G/A和211C/T在病例组和对照组中分别存在极显著差异和显著差异，且196号位对