tfeb的sumo化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的作用

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上海交通大学博士学位论文TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的作用姓名庞琦学号0127269336指导教师陈凤玲教授学科专业内科学（内分泌与代谢病）研究方向糖尿病大血管病变（动脉粥样硬化）申请学位医学博士资助基金国家自然科学基金(81270908)上海交通大学医学院博士创新基金(BXJ201344)答辩日期2015.5培养单位上海交通大学医学院附属第三人民医院 DoctoralDissertationofShanghaiJiaoTongUniversityRoleofTFEBSUMOylationinmacrophagefoamcellformationNameQiPangStudentnumber0127269336SupervisorProfessorFeng-lingChenProfessionaldisciplineInternalMedicine(Endocrineandmetabolicdisease)ResearchdirectionDiabeticmacrovasculardisease(Atherosclerosis)ApplicationDoctorDegreeGrantfoundationNationalNaturalScienceFoundation(81270908)DoctoralInnovationFundoftheShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine(BXJ201344)DateofdefenceMay,2015DepartmentShanghai3rdPeople’sHospital,Schoolofmedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity 上海交通大学博士学位论文TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的作用指导教师陈凤玲职称主任医师指导小组成员程金科职称研究员左勇职称副研究员蔡蓉职称副研究员杨架林职称主任医师研究生姓名庞琦 上海交通大学学位论文原创性声明：本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的肉容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本义的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：■Ｔ／曰期：扣辟月扣 上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留，、使用学位论文的规定同意学校保留并向国家有关部ｎ或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可１＾＾采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。＂＂（请在上方框内巧Ｖ）学位论文作者签名：私奇指导教师签名：个了ｒ／日期：如／年月／／日日期年月日 上海交通大学2012级博士学位论文TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的作用摘要研究背景动脉粥样硬化是诱发心脑血管疾病的重要病理基础，巨噬泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发病早期典型的病理改变。最新研究证实，巨噬细胞的自噬溶酶体活性与胆固醇代谢状况以及泡沫细胞的形成密切相关。因此，调控巨噬细胞的自噬过程，减少巨噬泡沫细胞的形成，成为治疗动脉粥样硬化及相关疾病的核心。近年来，SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，参与胚胎发生发育、肿瘤转移等多种生理病理过程，已成为近年来研究的热点。我们前期研究证实调控自噬溶酶体生成最重要的转录因子TFEB(transcriptionfactorEB)能够发生SUMO化修饰，因此，我们推测TFEB的SUMO化修饰通过调控自噬溶酶体生成参与了巨噬泡沫细胞的形成。目的本研究通过观察TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬体溶酶体生成的影响，深入探讨其在动脉粥样硬化巨噬泡沫细胞形成过程中的作用及机制。这些研究将有助于进一步了解蛋白质SUMO化修饰及其调控的生物学功能，并进一步了解巨噬泡沫细胞形成的机理及在动脉粥样硬化发生中的作用。方法一、培养THP-1巨噬细胞，给予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理24h，应用免疫共沉淀技术检测巨噬细胞TFEB的SUMO化修饰水平的变化。二、运用慢病毒技术构建过表达人TFEB(TFEB)和SUMO化位点突变的TFEBTHP-1(TFEBK316R)巨噬细胞株，以空载病毒细胞作为阴性对照组，应用电镜技术观察各组巨噬细胞自噬生成情况；应用免疫荧光技术及westernblot检测各组巨噬细胞1 上海交通大学2012级博士学位论文自噬生成标志LC3的表达情况。三、培养过表达TFEB和SUMO化位点突变的TFEB巨噬细胞，以空载病毒细胞作为阴性对照组，应用电镜技术及Lysotracker染色观察各组巨噬细胞溶酶体生成情况；应用免疫荧光技术及westernblot检测各组巨噬细胞中溶酶体生成标志LAMP1的表达情况。四、培养过表达TFEB和SUMO化位点突变的TFEB巨噬细胞，以空载病毒细胞作为阴性对照组，应用实时荧光定量PCR的方法检测各组巨噬细胞TFEB下游靶基因（自噬及溶酶体生成相关基因）的表达情况。五、培养过表达TFEB和SUMO化位点突变的TFEB巨噬细胞，以空载病毒细胞作为阴性对照组，给予ox-LDL处理24h，通过荧光分光光度计检测各组巨噬细胞总胆固醇(TC)、胆固醇酯(CE)含量及胆固醇酯水解率；用液体闪烁计数法检测各组巨噬细胞胆固醇流出率；六、培养过表达TFEB和SUMO化位点突变的TFEB巨噬细胞，以空载病毒细胞作为阴性对照组，给予ox-LDL处理24h，应用油红O及Nilered染色观察各组巨噬细胞泡沫细胞形成情况。结果一、在巨噬泡沫细胞形成过程中，TFEB的SUMO化修饰水平的改变培养人THP-1巨噬细胞，我们检测到了内源性TFEB的SUMO化修饰条带。并且，给予50μg/mLox-LDL刺激24h后，发现TFEB的SUMO化修饰水平较对照组明显降低，说明在ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中，TFEB的SUMO化修饰水平受到显著抑制。二、TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬的影响电镜结果显示：与对照组相比，TFEB组巨噬细胞内自噬体的数量明显增加，而TFEBK316R组巨噬细胞内自噬体的数量明显较TFEB组显著减少(均P<0.05)。并且，TFEB组巨噬细胞内自噬生成标志LC3的蛋白表达量较TFEBK316R组显著明显增加。这些结果说明TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞自噬。2 上海交通大学2012级博士学位论文三、TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞溶酶体生成的影响电镜和Lysotracker染色结果显示：与对照组相比，TFEB组巨噬细胞溶酶体数量增多(P<0.05)，体积增大；而TFEBK316R组巨噬细胞内溶酶体数量和体积较对照组无明显差异。并且，TFEB组巨噬细胞溶酶体生成标志LAMP1的蛋白表达量较TFEBK316R组明显增加。这些结果说明TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞溶酶体的生成。四、TFEB的SUMO化修饰对TFEB下游自噬及溶酶体生成基因表达的影响与对照组相比，过表达TFEB明显增加巨噬细胞自噬(LC3,ULK1,WIP1,ATG9B,Becline1)和溶酶体(LAMP1,CTSB,CLCN7,ATP6V1A)生成相关基因的表达，但是TFEBK316R组内自噬溶酶体生成相关基因的表达量较TFEB组明显降低(均P<0.05)。这些结果说明TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞自噬及溶酶体生成相关基因的表达。五、TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞胆固醇流出的影响与对照组相比，TFEB组巨噬细胞内TC和CE含量明显降低，胆固醇酯水解程度显著增加，apoA-I介导的胆固醇流出增多(均P<0.05)；而TFEBK316R组巨噬细胞内TC和CE含量较TFEB组明显增加，胆固醇酯水解程度显著降低，apoA-I介导的胆固醇流出减少(均P<0.05)。这些结果说明TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞内胆固醇酯的水解，增加胆固醇的流出。六、TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞形成的影响油红O及Nilered染色结果显示：与对照组相比，TFEB组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成明显减少；而TFEBK316R组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成较TFEB组显著增多，这些结果说明，TFEB的SUMO化修饰抑制了巨噬泡沫细胞的形成。结论一、在ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中，TFEB的SUMO化修饰水平明显降低，初步明确TFEB的SUMO化修饰与巨噬泡沫细胞形成的关系。3 上海交通大学2012级博士学位论文二、TFEB的SUMO化修饰通过增加自噬与溶酶体生成相关基因的表达，诱导巨噬细胞溶酶体的生成和自噬过程。三、TFEB的SUMO化修饰通过促进巨噬细胞脂质水解，促进胆固醇的流出，最终减少泡沫细胞的形成。关键词：TFEB；SUMO化修饰；巨噬泡沫细胞；动脉粥样硬化4 上海交通大学2012级博士学位论文RoleofTFEBSUMOylationinmacrophagefoamcellformationAbstractBackgroundAtherosclerosisisknowntobethemajorpathologicalbasistoinducecardiovasculardiseases,andmacrophagefoamcellformationisatypicalpathologicalchangeintheearlystageofatherosclerosis.Recentfindingsrevealedthattheautophagy-lysosomeinmacrophageshasbeenlinkedtocholesterolmetabolismandfoamcellformationduringatherosclerosis.Therefore,efficientregulationofmacrophageautophagyisessentialtopreventtheformationoffoamcellsandattenuatethedevelopmentofatheroscleroticlesions.Recently,covalentposttranslationalmodificationwithsmallubiquitin-likeproteins,particularlySUMO-1,hasbeenrecognizedtoplayanimportantroleindiversephysiologicalandpathologicalprocesses,suchasembryonicdevelopmentandthegrowthofmalignanttumors.TranscriptionfactorEB(TFEB)isamastertranscriptionalregulatorofautophagy-lysosomebiogenesis.Moreover,ourpreviousstudiesdemonstratedthatTFEBcouldbemodifiedbySUMO-1.WethereforeproposethatSUMOylationofTFEBplaysanimportantroleinfoamcellformationthroughregulatingautophagy-lysosomebiogenesisduringatherosclerosis.ObjectiveOurpresentstudyaimstoinvestigatetheeffectofSUMOylationofTFEBonautophagy-lysosomebiogenesis,andfurtherexploretheroleofTFEBSUMOylationinmacrophagefoamcellformationduringatherosclerosis.ThesefindingswillhelpustobetterunderstandthebiologicalfunctionofproteinSUMOmodificationandmayserveasanovelpotentialmechanismforregulatingmacrophagefoamcellformationintheprogressionof5 上海交通大学2012级博士学位论文atherosclerosis.Methods1.THP-1macrophagesweretreatedwith50μg/mLox-LDLfor24h,andthelevelofTFEBSUMOylationwasanalyzedbyimmunoprecipitates.2.ConstructTHP-1macrophagecelllinesstablyexpressinghumanTFEB(TFEB)andSUMOylationsitemutated-TFEB(TFEBK316R)bylentivirus-mediatedgenedelivery.Transmissionelectronmicroscopywasperformedtoobserveautophagosomesbiogenesis.TheexpressionofautophagymarkerLC3wasdeterminedbyimmunofluorescenceandwesternblot.3.CultureTFEBandTFEBK316Rmacrophages,TransmissionelectronmicroscopyandLysoTrackerredstainingwereperformedtoobservelysosomesbiogenesis.TheexpressionoflysosomebiogenesismarkerLAMP1wasdeterminedbyimmunofluorescenceandwesternblot.4.CultureTFEBandTFEBK316Rmacrophages,theexpressionofautophagyandlysosomebiogenesisrelatedgenewasdeterminedbyreal-timequantitativePCR(qRT-PCR).5.CultureTFEBandTFEBK316Rmacrophageswithorwithoutox-LDL(50μg/mL)for24h.Thetotalcholesterol(TC),cholesterolesters(CE)levelswereevaluatedusingfluorescentenzymaticassay.Cholesteroleffluxtolipid-freeapoA-IorHDLwasmeasuredbyliquidscintillationcounting.6.CultureTFEBandTFEBK316Rmacrophageswithorwithoutox-LDL(50μg/mL)for24h.Lipiddroplets(LDs)werevisualizedusingOilRedOandNileredstaining.Results1.TFEBSUMOylationisdecreasedinTHP-1macrophagestreatedbyox-LDLWeobservedthatTFEBcouldbemodifiedbySUMO-1inTHP-1macrophages;Moreover,SUMOmodificationofTFEBwassignificantlydecreasedafter24hof50μg/mLox-LDLtreatment.ThesedatasuggestedthatTFEBSUMOylationisdownregulatedinmacrophagesunderpro-atherogeneticconditions,anditmayplayacriticalroleinregulating6 上海交通大学2012级博士学位论文theformationofmacrophagefoamcells.2.SUMOylationofTFEBinducesmacrophageautophagyElectronmicroscopyshowedanincreaseinautophagosomebiogenesisinTFEBmacrophageswhileinTFEBK316Rmacrophagesthisincreasewasabolished.Moreover,theproteinlevelofLC3wassignificantlyhigherinTFEBWTmacrophagesthanthatinTFEBK316Rmacrophages.TheseresultsclearlyindicatedthatTFEBSUMOylationinducesmacrophageautophagy.3.SUMOylationofTFEBinducesmacrophagelysosomebiogenesisElectronmicroscopyandLysoTrackerstainingshowedanincreaseinlysosomenumberandlysosomalcompartmentinTFEBmacrophagesbutnotinTFEBK316Rmacrophages.Furthermore,immunofluorescenceandwesternblotshowedanincreasedamountofLAMP1inTFEBmacrophagescomparedtoTFEBK316Rgroup.TheseresultsclearlyindicatedthatTFEBSUMOylationcanenhancemacrophagelysosomebiogenesis.4.SUMOylationofTFEBaffectsmacrophageautophagyandlysosomebiogenesisgenesexpressionTFEBregulatesnotonlyautophagyrelatedgenes(LC3,ULK1,WIP1,ATG9BandBecline1),butalsolysosomebiogeneticgenes(LAMP1,CTSB,CLCN7,andATP6V1A).WeobservedanincreasedexpressionofthesegenesinTFEBmacrophages;however,theyweremarkedlyreducedafterK316mutation.TheseresultsclearlyindicatedthatTFEBSUMOylationcanaffectitsdownstreamgenesexpression,whichwasessentialtoautophagyandlysosomebiogenesisgenesexpressioninmacrophages.5.SUMOylationofTFEBenhancesmacrophagecholesteroleffluxTFEBmacrophagesexposedtoox-LDLhadlowerTCandCElevelsthanthoseofthecontrolgroup;whereas,comparedtotheTFEBgroup,theTFEBK316Rmacrophagesexposedtoox-LDLhadanincreasedlevelofTCcontentandCElevels.Importantly,overexpressionofTFEBinmacrophagesresultedinasignificantincreaseinCEhydrolysis,7 上海交通大学2012级博士学位论文whereasoverexpressingTFEBK316Rhadnosuchefficacy.Inconsistencewithpreviousdata,theapoA-I-mediatedcholesteroleffluxlevelswereincreasedintheTFEBgroup,comparedtothecontrolgroup,whileTFEBK316RgroupexhibitedsignificantlyreducedcholesteroleffluxbyapoA-IcomparedtotheTFEBgroup.TheseresultsindicatedthatTFEBSUMOylationpromotesmacrophageLDshydrolysisandenhancescholesterolefflux.6.SUMOylationofTFEBdecreasesmacrophagefoamcellformationOilredOandNileredstainingshowedthatoverexpressionofTFEBinmacrophagessignificantlydecreasedtheintracellularLDsaccumulation,whereas,thesephenotypicchangeswerelargelyreversedinTFEBK316Rmacrophages.Collectively,thesedataindicatedthatTFEBSUMOylationplaysaprotectiveroleintheformationofmacrophagefoamcells.Conclusions1.TFEBSUMOylationisdownregulatedinmacrophagesbyox-LDL,anditmayplayacriticalroleinregulatingtheformationofmacrophagefoamcells.2.TFEBSUMOylationinducesmacrophagelysosomebiogenesisandautophagyprocessbyregulatingtheexpressionoflysosomeandautophagybiogenesisgenes.3.TFEBSUMOylationpromotesmacrophageCEhydrolysis,enhancescholesterolefflux,andultimatelypreventsmacrophagefoamcellformation.Keywords:TFEB;SUMOylation;Macrophagefoamcell,Atherosclerosis8 上海交通大学2012级博士学位论文目录中文摘要...........................................................................................................1英文摘要...........................................................................................................5目录...........................................................................................................9英文缩略语词表.............................................................................................10论文正文TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的作用..........131.前言.............................................................................................132.材料与方法.........................................................................................203.结果.............................................................................................664.讨论.............................................................................................895.结论.............................................................................................94参考文献..................................................................................................95攻读学位期间发表的论著...........................................................................105致谢.......................................................................................................1069 上海交通大学2012级博士学位论文英文缩略语词表英文缩写英文全称中文全称ABCA1ATP-bindingcassetteA1ATP结合盒转运子A1ABCG1ATP-bindingcassetteG1ATP结合盒转运子G1AmpAmpicillin氨苄青霉素apoA-IapolipoproteinA-I载脂蛋白A-IASAtherosclerosis动脉粥样硬化ATGAutophagy-associatedgene自噬相关基因bpBasepairs碱基对bHLH-LZbasic-helix-loop-helixleucinezipper螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白CECholesteroleaster胆固醇酯DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚ddH2ODoubledistilledwater双蒸水DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDulbecco改良的Eagle培养基DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸E.coliEscherichiacoli大肠埃希氏杆菌FCFreecholesterol游离胆固醇hHour小时HBSSHank’sBalancedSaltSolutionHank’s平衡盐溶液HDLHighdensitylipoprotein高密度脂蛋白10 上海交通大学2012级博士学位论文HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IgGImmunoglobulinG免疫球蛋白GIODIntegratingOpticalDensity积分光密度kdkilodalton千道尔顿LLiter升LBLuria-BertanimediaLB培养基LDLLow-densitylipoprotein低密度脂蛋白LRH-1Liverreceptorhomolog-1肝受体类似物-1mgMilligram毫克mLMililiter毫升MiTFMicrophthalmia-transcriptionfactor小眼相关转录因子ox-LDLOxidizedlow-densitylipoprotein氧化低密度脂蛋白PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSPhosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏氟乙烯PCRPolymerasechainreaction多聚合酶链式反应PMAPhorbol-12-myristate-13-acetate佛波酯peroxisomeproliferator-activated过氧化物酶体增殖物激活PGC1αreceptor-γcoactlvator受体γ辅激活子peroxisomeproliferator-activated过氧化物酶体增殖物激活PPARαreceptor-α受体αQRT-PCRReal-timequantitativePCR实时荧光定量PCRRTReversetranscription逆转录RCTReversecholesteroltransport胆固醇逆向转运SRScavengerreceptor清道夫受体11 上海交通大学2012级博士学位论文TCTotalcholesterol总胆固醇μLMicroliter微升12 上海交通大学2012级博士学位论文TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的作用1.前言心脑血管疾病是目前导致人类死亡与残疾的主要疾病之一，严重地危害了人类生命健康[1,2]。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是诱发心脑血管疾病的重要病理基础。目前普遍认为，AS是一种病因复杂的慢性疾病，与多种危险因素包括血脂紊乱、糖尿病、肥胖和高血压密切相关[3-5]。近年来，随着介入治疗以及他汀类药物的应用，AS诱发的心脑血管疾病的治疗取得了一定的临床效果[6,7]。但是，对于AS的病理机制，至今仍尚未完全阐明，仍须进一步探讨，以利于及早干预其发展过程和获取最佳的治疗效果。一、巨噬泡沫细胞的形成及其作用是动脉粥样硬化斑块形成、发展的关键AS的发病机制有多种学说，如脂质浸润学说、血液动力学说、损伤反应学说、氧化低密度脂蛋白学说等，目前较为公认的是Ross[8]提出的损伤应答学说，即AS是内皮细胞损伤引起的动脉壁的一种慢性炎性反应，其过程包括：1.内皮细胞损伤和功能失调是AS的始动因素。健康的血管内皮细胞不但可以抑制血小板附着、白细胞黏附，而且能够保持纤维蛋白溶解物前体与血栓激活物前体的平衡。目前传统的致动脉硬化因素均与内皮细胞功能失调有关，内皮功能失调直接表现为促炎性反应与血栓的形成[9]。在诸多心血管危险因素如高血脂、血流动力学应激等刺激下，造成内皮细胞的慢性损伤，其结果是内皮细胞的功能异常，血管壁通透性增加[10,11]。2.单核细胞进入血管壁被认为是AS发生的关键步骤。受损的内皮细胞表面表达多种选择素类、整合素类、免疫球蛋白超家族类等黏附分子，并释放单核细胞趋化分子、巨噬细胞集落刺激因子等细胞分子，促进血循环中的单核细胞的黏附。在上述各种黏附分子和细胞因子的作用下，单核细胞被招募且黏附到血管内膜，迁移进入内皮下间隙，并在各种因子的介导下分化为巨噬细胞[12-14]。3.巨噬泡沫细胞的形成是AS发病早期典型的13 上海交通大学2012级博士学位论文病理改变。正常情况下，血液单核细胞表面清道夫受体表达较少，然而，当其进入内膜受到修饰性低密度脂蛋白刺激后，巨噬细胞可表达多种清道夫受体(SRs)包括包括清道夫受体-A(SR-A)、清道夫受体-BI(SR-BI)、CD36、及磷脂酰丝氨酸等。并通过该类受体介导的胞吞作用吞噬大量修饰性低密度脂蛋白，从而在血管壁上形成泡沫细胞并大量堆积导致斑块的形成[15,16]。巨噬泡沫细胞的形成构成了AS斑块早期损伤、脂质条纹的主体，是AS发病的标志性事件。4.巨噬泡沫细胞的形成促进AS的发生发展。巨噬泡沫细胞在血管壁不断形成并大量聚集，并且，随着单核细胞的不断的迁移入内膜，导致动脉粥样硬化病灶核心不断增大。在AS后期，巨噬泡沫细胞的凋亡在促进动脉斑块坏死核心、动脉不稳定斑块以及血栓的形成过程中具有重要作用[17,18]。因此，巨噬泡沫细胞的形成及其作用是动脉粥样硬化斑块形成、发展的关键。二、细胞胆固醇代谢参与巨噬泡沫细胞的形成胆固醇逆向转运(reversecholesteroltransport,RCT)是周围细胞胆固醇转运至肝脏转化、清除的重要生理过程,它在维持机体胆固醇代谢平衡中发挥重要作用，是机体抗AS发生及发展的最主要机制[19,20]。自从1973年Glomset等[21]第一次提出这个概念后，此途径作为动脉粥样硬化的治疗靶点受到越来越多地重视。正常情况下，修饰性低密度脂蛋白被巨噬细胞清道夫受体摄取后被中性胆固醇水解酶分解为游离胆固醇，通过细胞膜上的转运体ATP结合盒转运子A1(ATP-bindingcassetteA1,ABCA1)和ATP结合盒转运子G1(ATP-bindingcassetteG1,ABCG1)介导从细胞流出，转运至载脂蛋白A-I(apolipoproteinA-I,apoA-I)和高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)，随血液循环至肝脏，与肝细胞表面受体结合，被选择性摄取后转变为胆汁酸盐，继而由粪便排出体外，从而维持巨噬细胞内胆固醇的稳态，最终减少脂质在巨噬细胞的聚集和泡沫细胞的形成[19,20]。在巨噬泡沫细胞的形成的过程中，巨噬细胞脂质摄取、合成和水解、及胆固醇流出处于平衡状态，若脂质摄取过多或者胆固醇流出减少，均可导致大量脂质的聚集及泡沫细胞的形成。其中，胆固醇的摄取与流出是巨噬细胞保持胆固醇动态平衡的重要方式，而巨噬细胞胆固醇流出作为RCT的第一步，也是其限速步骤[22-24]。Tangier病是一种遗传代谢障碍疾病，由于ABCA1基因突变引起胆固醇逆向14 上海交通大学2012级博士学位论文转运功能障碍，胆固醇在外周细胞特别是巨噬细胞、网状内皮系统细胞大量积聚，导致Tangier病人动脉粥样硬化、冠心病、脑血管意外的高发病率[25-28]。新近对Tangier病的研究表明，ABCA1基因编码的胆固醇流出调节蛋白在细胞内RCT过程中起重要作用，促进胆固醇外流极有可能成为有效治疗AS的手段[29,30]。肝X受体(1iverXreceptor，LXR)是机体保持胆固醇相对稳定的关键感受器和调节因子，通过调控RCT过程从而发挥抗AS的作用[31-33]。研究发现LXR基因敲除的ApoE-/-小鼠RCT过程被削弱，导致动脉壁中大量泡沫细胞形成，动脉粥样硬化程度明显加重。LXR激动剂能明显增加巨噬细胞胆固醇流出及RCT过程，减轻ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生、发展[34,35]。目前，多种降脂类药物如贝特类和烟碱等，被证实可通过促进HDL主要载脂蛋白apoA-I表达，升高HDL水平，促进巨噬细胞胆固醇流出和RCT过程，发挥抗AS的作用[36-38]。因此，调控细胞胆固醇流出，减少巨噬泡沫细胞的形成，成为治疗动脉粥样硬化及相关疾病的核心。三、自噬与细胞胆固醇代谢及巨噬泡沫细胞的形成密切相关自噬(Autophagy)是通过溶酶体系统降解细胞毒性蛋白、受损的细胞器和各种大分子物质的过程，产生能够为细胞提供能量的氨基酸等物质，使其能够适应各种应激和饥饿等环境，是机体维持细胞内环境稳定和代谢平衡的重要途径[39,40]。近年来，自噬已成为生物学领域的一个研究热点，其在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用[41-47]。根据细胞内底物转运到溶酶体腔方式的不同，自噬分为3种主要方式：大自噬(macroautophagy)、小自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-medicatedautophagy)。大自噬是指细胞中的衰老或者失去功能的蛋白质及细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构所包裹形成自噬体，自噬体再将其携带到溶酶体中进行降解加工的过程；微自噬是指细胞溶酶体直接包裹并降解细胞内物质的过程；分子伴侣介导的自噬指的是细胞中可溶的蛋白质分子通过分子伴侣进入到溶酶体中被降解的过程。这些自噬过程都有一个共同点，即都是在溶酶体中实现蛋白的降解。而在这三种自噬方式中，大自噬是最具自噬特点15 上海交通大学2012级博士学位论文的自噬形式。大自噬的形成过程大致可分为四个阶段：1.自噬的诱导，在诱导自噬发生的环境下，如饥饿、氧化应激、或细胞损伤等应激时，细胞浆中出现大量游离的双层膜性结构，称为前自噬泡或分隔膜；2.自噬体的形成，分隔膜泡逐渐延伸，将待降解的蛋白质或者细胞器完全包裹形成自噬体。3.自噬溶酶体的生成，成熟的自噬体与细胞骨架微管系统相互作用，被运输到溶酶体，其外膜与溶酶体融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体，形成自噬溶酶体。4.自噬体的降解与再循环。首先，在诱导自噬发生的环境下，如饥饿、氧化应激、或细胞损伤等应激时，细胞浆中出现大量游离的双层膜性结构，称为前自噬泡或分隔膜；分隔膜泡逐渐延伸，将待降解的蛋白质或者细胞器完全包裹形成自噬体。成熟的自噬体与细胞骨架微管系统相互作用，被运输到溶酶体，其外膜与溶酶体融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体，形成自噬溶酶体。随后，溶酶体内的水解酶将内膜内带降解的物质水解，产生为细胞生存所必需的组成成分，例如氨基酸，核苷酸，被细胞再利用，从而维持细胞内代谢及物质平衡[39,40,49]。目前，在酵母和其他真核生物中鉴定了许多参与自噬的基因，这些基因被命名为自噬相关基因(Autophagy-relatedgenes,ATG)。他们编码的蛋白组成的复合物在自噬的各个阶段中起到重要作用。近年来研究发现，细胞内一些蛋白质或者细胞器也能够被选择性自噬所降解，如线粒体自噬(Mitophagy)、内质网自噬(Reticulophagy)、核糖体自噬(Ribophagy)、过氧化物酶体自噬(Pexophagy)等[49-51]。2009年，“脂质自噬(lipophagy)”作为一种新的特殊形式的自噬被提出，即细胞中蓄积的大量脂滴被非溶酶体来源的双层膜结构包裹与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，并由溶酶体内的酸性脂解酶水解成游离的胆固醇，促进胆固醇流出，参与RCT过程[49,52]（图1）。随后，Ouimet等[53]研究表明，巨噬细胞自噬可以促进胆固醇的流出，减少泡沫细胞的形成。应用氯喹(chloroquine,一种自噬抑制剂)抑制脂噬这一重要的脂质代谢过程后，细胞中胆固醇流出明显减少，泡沫细胞的形成显著增加。体内研究将ApoE-/-小鼠巨噬细胞自噬相关基因5(ATG5)沉默后，造成巨噬细胞自噬能力降低，RCT过程受到抑制，加速了动脉粥样斑块的形成。最近研究发现，WIP1在调控自噬中扮演着一个重要的角色，将WIP1基因沉默导致巨噬细胞向泡沫细胞的转变受到16 上海交通大学2012级博士学位论文抑制，从而阻止或减缓了AS斑块的形成[54,55]。此外，大量研究发现自噬可以影响斑块巨噬细胞的浸润、炎症因子的释放及易损和有破裂倾向斑块的稳定性[56-58]。总之，这些研究证实巨噬细胞自噬在AS的发生、发展过程中起着关键性的作用。图1巨噬泡沫细胞内自噬调节胆固醇代谢模式Fig.1Modelofautophageregulatescholesterolcatablisminmacrophagefoamcell四、TFEB是调控自噬溶酶体的生成的重要转录因子转录因子TFEB(transcriptionfactorEB)是调控自噬过程最重要的转录因子[59-61]。TFEB属于bHLH-LZ类转录因子中MiTF亚家族成员，通过与溶酶体及自噬相关基因启动子区CLEAR元件结合，调控溶酶体与自噬相关基因的表达，参与调节自噬体与溶酶体的形成及融合、底物的降解等自噬过程多个阶段，在癌症、神经退行性疾病、心血管疾病等自噬相关疾病的发生中起到重要的作用[62-69]。目前，大量研究证实TFEB与脂质代谢密切相关：Palmieri等[70]通过基因芯片分析发现TFEB可以调节一系列与脂肪代谢途径中多个步骤相关基因的表达，包括ABP-p、CD36和Cpt-2等脂肪酸运输相关基因、MCAD和Acca1β等脂肪酸β氧化相关基因。并且,溶酶体降解途径最关键水解酶LAL也被证实是TFEB的一个靶基因[70]。随后，Settembre等[71]发现，在饥饿状态下，TFEB通过自噬依赖的途径影响脂代谢关键调控因子PGC1α和PPARα的表达，参17 上海交通大学2012级博士学位论文与了细胞脂质代谢这一重要生理过程。体内研究发现，肝脏特异性过表达TFEB的小鼠较正常小鼠体重明显减轻，代谢综合征的发病率明显降低；而在肝脏特异性敲除TFEB的小鼠，肝细胞自噬水平降低，脂代谢受阻，进一步加剧脂质的蓄积从而引发脂肪肝等疾病。上述体内、体外研究均提示TFEB通过调控自噬过程影响细胞脂质代谢过程。上述体内、体外研究均提示TFEB通过调控自噬过程影响细胞脂质代谢过程。五、SUMO化修饰是调控AS形成的一种重要机制近年来，SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)化修饰作为一种细胞内广泛存在且重要的蛋白质翻译后修饰过程，参与胚胎发生发育、分化增殖、肿瘤转移等多种生理病理过程[72-74]。与泛素化修饰类似，SUMO化修饰也是一个由特异性的活化酶(E1)、结合酶(E2)和连接酶(E3)共同催化的酶促级联反应过程，从而将SUMO共价结合到靶蛋白的赖氨酸残基上。SUMOs是一类高度保守的蛋白质家族，为大多数真核细胞的生存所必需。1995年第一个SUMO基因smt3在酿酒酵母中被发现，该基因所编码的蛋白SMT3仅仅被认为具有参与调控有丝分裂和减数分裂的功能。随着研究的不断深入，越来越多的蛋白被发现能够发生SUMO化修饰，因此，SUMO化修饰的功能也从最初的调控基因转录扩展到广泛地参与调控蛋白质的定位、酶的活性以及蛋白与蛋白之间的相互作用，从而影响蛋白质的降解及功能。SUMO化修饰是一动态可逆的过程，其反向作用去SUMO化(de-sumolylation)受到一组SUMO特异性蛋白酶SENP(SUMO/Sentrin-specificprotease1)家族的调节[75,76]（图2）。在哺乳动物中，这一家族包括SENP1-3、SENP5-7，它们定位在不同的亚细胞区并分别承担对不同SUMO片段的剪切成熟和催化SUMO片段从底物上去连接的功能，因此去SUMO化作用对于决定蛋白质SUMO化修饰程度起着重要作用[75,76]。已有研究表明：SUMO-2/3对促凋亡因子p53和促炎因子ERK5的共价修饰，可以抑制p53和ERK5的转录活性，减少内皮细胞的凋亡和炎症因子的释放，从而延缓动脉粥样硬化的进展[77-79]。并且体内外研究进一步证实SENP2能够逆转p53和ERK5的SUMO化修饰，并且SENP2-/-ApoE-/-小鼠发生动脉粥样硬化程度较正常对照组明显减轻[80]。肝受体类似物-1(liverreceptorhomolog-1,LRH-1)是胆汁酸代谢通路中重要的18 上海交通大学2012级博士学位论文核受体。最新研究发现LRH-1的SUMO化修饰能够抑制RCT基因的表达；LRH-1的SUMO位点突变小鼠的动脉粥样硬化病变程度较正常对照小鼠明显减轻[81]。这些结果证实SUMO化修饰在动脉粥样硬化中发挥着重要作用。图2蛋白SUMO化修饰是一个动态可逆的过程Fig.2ProteinSUMOylationisareversibleprocess基于上述研究进展，我们前期研究证实TFEB能够被SUMO-1修饰，然而SUMO化修饰TFEB是否参与了AS的发生、发展过程，目前尚缺乏相关研究。本研究通过观察TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬溶酶体生成的影响，进一步阐明其在氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬泡沫细胞形成中的作用与机制，为AS的发病机制提供了一个新的视角，并为临床动脉粥样硬化疾病的治疗提供新的靶点和方向。19 上海交通大学2012级博士学位论文2.材料与方法2.1实验材料、试剂及仪器2.1.1实验材料2.1.1.1细胞株人胚胎肾293T细胞购于美国ATCC公司人白血病THP-1单核细胞购于美国ATCC公司人宫颈癌HeLa细胞购于美国ATCC公司2.1.1.2质粒pEGFP-N1-TFEB购自addgenepEGFP-N1-TFEB-K316R通过环状PCR引入点突变扩增而来FLAG-SUMO-1由上海交通大学医学院程金科教授实验室提供HA-Ubc9由上海交通大学医学院程金科教授实验室提供pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP由上海交通大学医学院程金科教授实验室提供PMD2G由上海交通大学医学院程金科教授实验室提供PSPAX2由上海交通大学医学院程金科教授实验室提供pCDH-TFEB-GFP通过常规分子克隆方法构建而来pCDH-TFEB-K316-GFP2.1.2实验试剂兔抗TFEB抗体CellSignalingTechnology兔抗GFP抗体CellSignalingTechnology兔抗SUMO-1抗体CellSignalingTechnology兔抗LC3抗体CellSignalingTechnology兔抗LAMP1抗体CellSignalingTechnology兔抗LaminB抗体Abcam20 上海交通大学2012级博士学位论文兔抗GRP78抗体Abcam兔抗β-actin抗体CellSignalingTechnology鼠抗FLAG-M2抗体SigmaHRP标记抗兔IgG二抗SigmaHRP标记抗小鼠IgG二抗Sigma限制性内切酶NotIFermentas限制性内切酶NheIFermentasT4DNA连接酶Takara氨苄霉素Gibco卡那霉素Gibco嘌呤霉素Gibco蛋白胨Promega酵母提取物Promega氯化钠Amresco琼脂糖PromegaAgaroseBIOWESTE.coliDH5α感受态细菌TaKaRaDNA凝胶回收试剂盒OMEGA质粒小量提取试剂盒OMEGA质粒大量提取试剂盒OMEGARPMI1640培养基HycloneDMEM高糖培养基Hyclone胎牛血清Hyclone胰酶Invitrogen青霉素、链霉素双抗Gibco21 上海交通大学2012级博士学位论文PMASigma二甲基亚砜（DMSO）SigmaLipofectamine2000InvitrogenOpti-MEMInvitrogenPolybreneInvitrogenTRIzolInvitrogenRNA逆转录试剂盒TakaraSYBRGreenPCRMasterMixAppliedBiosystemsPVDF膜MilliporeECL显影液MilliporeSDSSigma脱氧胆酸钠SigmaTEMEDSigmaβ-巯基乙醇AmrescoTris-BaseAmresco甘氨酸Amresco过硫酸铵SCRC30%丙烯酰胺碧云天HBSS碧云天NP-40上海生工甘油上海生工溴酚蓝上海生工Tween-20上海生工TritonX-100上海生工甲醇上海大合22 上海交通大学2012级博士学位论文盐酸上海凌峰氯仿SCRC异丙醇SCRC无水乙醇SCRC冰醋酸SCRC多聚甲醛SCRC戊二醛SCRCPMSF上海生工蛋白酶抑制剂RocheDNAmaker康维生物ProteinmakerCellSignaling油红OSigmaNileredSigmaox-LDL奕源生物DAPIInvitrogenAmplexRedcholesterolassaykitInvitrogen3H-胆固醇PerkinElmerLifeSciencesapoA-ISigmaHDLSigmaLysoTrackerRedSigmaBCA蛋白定量试剂盒碧云天2.1.3主要溶液及试剂配制2.1.3.1PBS溶液(PH7.4)：NaCl8.0g，KCl0.2g，NaH2PO42.7g，KH2PO40.24g，ddH2O充分溶解，调pH至7.4，ddH2O定容至1L，经高温高压灭菌后备用。2.1.3.20.1%DEPC水：取0.5mLDEPC于500mLddH2O中，制备0.1%DEPC水，上下振荡后，使DEPC溶液充分混匀溶解，过夜，经高温高压灭菌后，4°C保存23 上海交通大学2012级博士学位论文备用。2.1.3.31×TAE电泳缓冲液：96.8gTris-Base，22.84mL冰醋酸，14.88gNa2EDTA·2H2O，ddH2O充分溶解后，定容至20L。2.1.3.41%琼脂糖凝胶：0.5g琼脂糖，50mLTAE，混匀后于微波炉中煮沸，使琼脂糖完全溶解，冷却后加入10μL核酸染料溴化乙锭(EB)并充分混匀。然后将琼脂糖混合物缓慢倒入胶床，赶走气泡后插上梳子，室温放置待凝胶凝固。2.1.3.5LB液体培养基：10g胰蛋白胨，10gNaCl，5g酵母提取物，ddH2O充分溶解后，定容至1L，经高温高压灭菌后，4°C保存备用。2.1.3.6氨苄（卡那）抗性的LB平板：配置1L的LB液体培养基，加入20g琼脂糖，高温高压灭菌20min后，充分混匀琼脂糖，待培养基冷却至50-60°C，加入氨苄霉素（卡那霉素），使其终浓度达到100μg/mL，待培养基自然冷却后，封装保存于4°C备用。2.1.3.7SDS-PAGE分离胶(10mL)10%12%15%ddH2O(mL)4.03.32.330%丙烯酰胺(mL)3.34.05.01.5MTris-HCl(pH8.8)(mL)2.52.52.510%SDS(mL)0.10.10.110%过硫酸铵(mL)0.10.10.1TEMED(mL)0.0040.0040.0042.1.3.8SDS-PAGE浓缩胶(6mL)：30%丙烯酰胺1.0mL，1MTris-HCl(pH6.8)0.75mL，10%SDS0.06mL，ddH2O4.1mL，混匀后再加入10%过硫酸铵0.06mL，TEMED0.006mL。2.1.3.91.5MTris-HCl(pH8.8)溶液：181.7gTris，用800mLddH2O充分溶解，用浓盐酸调pH至8.8，ddH2O定容至1L，经高温灭菌后室温保存备用。24 上海交通大学2012级博士学位论文2.1.3.101MTris-HCl(pH6.8)溶液：121.1gTris，用500mLddH2O充分溶解，用浓盐酸调pH至6.8，ddH2O定容至1L，经高温灭菌后室温保存备用。2.1.3.1110%SDS：10gSDS加蒸馏水至100mL，68°C水浴溶解，室温保存备用。2.1.3.1210%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵，用1mLddH2O溶解，4°C保存备用。2.1.3.1310×电泳缓冲液：30gTris-Base，144g甘氨酸，10gSDS，ddH2O溶解，定容至1L，用前稀释成1×的工作液。2.1.3.1410×转膜缓冲液：30gTris-Base，144g甘氨酸，800mLddH2O，ddH2O溶解，定容至1L。室温保存。取10×的工作液100mL，ddH2O定容至800mL，使用前加入200mL甲醇，并提前预冷。2.1.3.15RIPAbuffer(500mL)：50mMTris-HCl(pH7.4)；150mMNaCl；1mMEDTA；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS；ddH2O定容至500mL，于4°C保存，使用前加入相应的蛋白酶或磷酸酶抑制剂，并提前预冷。2.1.3.162×SDSloadingbuffer(10mL)：1MTris-HCl(pH6.8)1mL，50%甘油4mL，10%SDS4mL，β-巯基乙醇1mL，1%溴酚蓝0.1mL。2.1.3.171×TBST溶液：1MTris-HCl(pH7.4)400mL，5MNaCl534mL，Tween-2020mL，ddH2O定容至20L。2.1.3.185%牛奶封闭液：取1g脱脂奶粉溶于20mLTBST中，混匀后室温放置备用。2.1.3.1910mMPMSF溶液：PMSF1.74mg，加异丙醇10mL溶解后，分装于1.5mLEP管中，-20°C保存备用。2.1.3.20核质分离Buffer：BufferA(50mL,pH7.9)：20mMHEPES-KOH0.5mL，1.5MMgCl275μL，10mMKCl0.5mL，0.5mMDTT25μL，0.2mMPMSF100μL，ddH2O定容至50mL。BufferB(50mL,pH7.9)：20mMHEPES-KOH1mL，1.5MMgCl275μL，0.4MNaCl4.2mL，0.5mMDTT25μL，0.2mMPMSF20μL，0.2mMEDTA100μL，25%glycerol25mL，ddH2O定容至50mL。25 上海交通大学2012级博士学位论文2.1.3.21油红O染液储存液：取0.5g油红O溶于100mL异丙醇，加热促进溶解，室温避光保存。2.1.3.22Nilered储存液：取0.01gNilered溶于10mL丙酮，反复吹打混匀，4°C避光保存。2.1.3.23DAPI储存液：取0.01gDIPA溶于10mLddH2O，吹打混匀，-20°C避光保存。2.1.3.244%多聚甲醛：取4g多聚甲醛溶于100mLPBS，加热促进溶解，溶解完全后，室温保存。2.1.3.251MNaOH：取0.4gNaOH溶于100mLddH2O，加热促进溶解，室温避光保存。2.1.4实验仪器细胞培养箱Thermo超净工作台Thermo移液器Eppendorf超速冷冻离心机Eppendorf低温高速离心机Eppendorf普通PCR仪EppendorfND-2000超微量分光光度计Nanodrop纯水仪MilliporepH计Sartorius电子天平Sartorius恒温混匀器Eppendorf恒温水浴箱上海一恒旋涡混匀器上海一恒细菌平板培养箱Sanyo26 上海交通大学2012级博士学位论文制冰机Sanyo细菌摇床Innova7500型PCR仪AppliedBiosystemsWesternblot全套系统Bio-Rad电泳仪Tanon琼脂糖胶电泳槽Tanon凝胶成像系统Tanon4°C药品保存箱Haier-80°C低温冰箱Sanyo酶标分析仪UVP倒置显微镜Olympus荧光测定仪Promega酶标仪Thermo电镜JEM激光共聚焦Olympus2.2实验方法2.2.1细胞复苏、培养、传代及冻存2.2.1.1细胞复苏及培养(1)配置完全培养基：HEK293T和HeLa细胞株培养基为含有10%胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基。人白血病THP-1单核细胞株培养基为含有10%灭活胎牛血清（将胎牛血清至于水浴箱56°C30min），100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基。(2)将冻存的1管细胞株从液氮罐取出，迅速放入37°C水浴锅中摇晃，使其在1min内完全解冻。(3)用75%乙醇消毒管口，洁净纸巾擦干，将细胞悬液吸至预先加入完全培养基的15mL离心管中，800g，离心5min。27 上海交通大学2012级博士学位论文(4)吸弃上清液，在离心管中加入2mL完全培养基重悬细胞沉淀后，移入10cm的培养皿中，置于37°C细胞培养箱中培养，第二天观察细胞生长情况及培养液的PH值（颜色变化）、清亮度（是否污染）。隔天换液，待细胞长至70%~80%汇合度时传代。2.2.1.2细胞传代HEK293T和HeLa细胞传代：(1)吸弃原细胞培养皿内的培养基，沿培养皿边缘小心加入PBS5mL，左右摇晃培养皿后吸弃PBS，重复一次；(2)加入2mL0.25%胰酶消化液，轻微晃动，使胰酶均匀分布；(3)将培养皿放入37°C细胞培养箱静置1~2min，在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞变圆、细胞间隙变大时，加入3~4mL完全培养基终止消化；(4)轻轻吹打使细胞脱离培养皿底部，并轻轻吹打成细胞悬液；(5)收集细胞悬液移入15mL离心管，800g，离心5min；(6)吸弃上清液，加入1mL完全培养基重悬细胞沉淀，显微镜下细胞计数，根据实验要求调整细胞密度后，将细胞接种于新的培养皿或者铺板，于37°C的细胞培养箱中培养，用于后续试验。THP-1单核细胞传代：(1)将细胞悬液轻轻吸打，移入15mL离心管，800g，离心5min；(2)吸弃上清液，加入5mLPBS重悬细胞沉淀，吸打成单细胞悬液，800g，离心5min；(3)吸弃上清液，加入1mL完全培养基重悬细胞沉淀，吸打成单细胞悬液，将细胞均匀分配于新的培养皿中，加入适量新鲜培养基，于37°C的细胞培养箱中继续培养。2.2.1.3细胞冻存(1)冻存液的配置：按完全培养基:胎牛血清:DMSO=7:2:1的比例配制细胞冻存液；(2)选择处于对数生长期的细胞，待细胞长至70%~80%汇合度时，吸弃原培养皿内培养液，PBS漂洗2~3次；28 上海交通大学2012级博士学位论文(3)加入2mL0.25%胰酶消化液，消化、终止消化和离心步骤同上；(4)弃上清液，分别将冻存液加入消化完全的细胞中，用滴管轻轻吹打混匀；(5)在每支冻存管中加入1mL细胞混合液，密封后标记冻存细胞名称、代数和冻存日期。(6)冻存步骤的细致直接关系到细胞复苏时的活力，将冻存管在-20°C放置30min，-80°C冰箱过夜，次日置入液氮罐中长期保存。注：DMEM高糖培养基、RPMI1640培养基、PBS、胰酶等试剂在使用前原则上都应在37°C水浴锅中预热，以减少对细胞的刺激与损害。2.2.2表达载体的构建2.2.2.1pEGFP-N1-TFEB质粒转化、抽提及鉴定2.2.2.1.1pEGFP-N1-TFEB质粒转化与涂板(1)含人TFEB基因的质粒pEGFP-N1-TFEB购于美国Addgene，货号38119；其图谱见图3；(2)将DH5α感受态细胞从-80°C冰箱取出，放置于冰上化冻；(3)取10μL感受态细胞放入新的EP管中，其余放入-80°C冰箱保存；(4)取1μL质粒加入到EP管中与感受态轻柔混匀，冰上放置30min；(5)将EP管放入42°C水浴锅内水浴90s后，立即冰上放置5min；(6)在EP管中加入800μL不含抗生素的LB培养基，置于37°C摇床，150rpm摇菌1h；(7)将EP管4500rpm，离心2min，吸弃500μL上清；(8)取100μL均匀地涂布于含100μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，倒置放入37°C细菌培养箱培养12~18h；(9)待克隆长出后，在无菌状态下挑取单个菌落若干，分别加入4~5mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，置37°C摇床，200rpm摇菌12~18h。29 上海交通大学2012级博士学位论文图3pEGFP-N1-TFEB质粒图谱Fig.3MapofpEGFP-N1-TFEBplasmid2.2.2.1.2pEGFP-N1-TFEB质粒抽提采用美国OMEGA公司的质粒小抽试剂盒。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤如下：(1)取1.5mL菌液置于新EP管中，室温10000g，离心1min，吸弃培养基；(2)再吸取1.5mL菌液置于EP管中，室温10000g，离心1min，吸弃培养基；(3)加入250μLSolutionI/RNaseA混合液，吸打混匀细胞，使细胞完全悬浮；(4)加入250μLSolutionII，轻轻上下颠倒混匀4~6次；注：此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min。(5)加入350μLSolutionIII，轻轻上下颠倒数次至形成白色絮状沉淀；(6)室温13000g，离心10min；(7)将上清液转移至套有2mL收集管的HiBindDNA结合柱中，室温10000g，离心1min，倒去收集管中的滤液；30 上海交通大学2012级博士学位论文(8)将柱子重新装回收集管，加入500μLHBBuffer，室温10000g，离心1min，弃滤液；(9)将柱子重新装回收集管，加入700μLDNAWashBuffer，室温10000g，离心1min，弃滤液；(10)重复步骤(9)一次；(11)将柱子重新装回收集管，室温10000g，离心2min，以甩干柱子基质；(12)将柱子装在1.5mL新离心管上，加入30~50μLElutionBuffer，静置1~2min，室温13000g，离心1min，洗脱出质粒DNA。(13)吸取1μL质粒，用NP-2000超微量分光光度计检测质粒DNA样品浓度。2.2.2.1.3pEGFP-N1-TFEB质粒酶切鉴定(1)试剂准备：pEGFP-N1-TFEB质粒，NotI，NheI，10×Buffer，ddH2O。(2)在1.5mLEP管内中依次加入以下试剂，反应体系如下：表1双酶切反应体系试剂组分体积或终浓度pEGFP-N1-TFEB5.0μLNotI1.0μLNheI1.0μL10×Buffer5.0μLddH2O38μLTotal50μL(3)反应条件：37°C水浴1h。(4)酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像。1)1%琼脂糖凝胶配置：称取0.5g琼脂糖，加入到50mLTAE缓冲液中，轻31 上海交通大学2012级博士学位论文摇混匀；2)置微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶解，冷却后按1:10000加入EB并充分混匀；3)将琼脂糖混合物缓慢倒入胶床，赶走气泡，插上梳子，室温放置待凝胶凝固；4)将梳子小心拔出，水平放置于电泳槽内，电泳槽内加入TAE缓冲液至液面略高出凝胶表面；5)用移液器将50μL质粒双酶切样品小心加入点样孔中，在第一个点样孔中加入DNAMarker；6)以电压145V，电泳30min；7)待电泳结束，取出琼脂糖凝胶，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像，拍照并保存。(5)经双酶切鉴定正确的pEGFP-N1-TFEB质粒送上海生物工程技术有限公司测序。2.2.2.2TFEBSUMO位点突变质粒构建2.2.2.2.1引物设计及合成：应用PrimerPremier5软件设计，由上海生物工程有限公司合成，具体序列如下：表2点突变引物序列pEGFP-N1-TFEBK316R引物序列正向5’-GGCCCAGCAGGTGGTGAGGCAGGAGCT-3’反向5’-AGCTCCTGCCTCACCACCTGCTGGGCC-3’2.2.2.2.2PCR扩增(1)将下述试剂依次加入PCR管内(冰上操作)：32 上海交通大学2012级博士学位论文表3PCR反应体系试剂组分体积或终浓度pEGFP-N1-TFEB质粒模板(50ng)0.5μL正向引物(10μM)1.0μL反向引物(10μM)1.0μLdNTP1.5μLPfu聚合酶1.0μL10×Pfubuffer2.5μLddH2O12.5μLTotal20μL(2)将PCR管震荡后，短暂离心，充分混匀试剂；(3)扩增程序：95°C3min95°C30s60°C45s15cycles72°C1min72°C15min(4)PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像。1)PCR扩增产物与6×DNA上样缓冲液混匀后上样，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶，稳压145V，电泳30min。2)观察PCR产物条带，待电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像，拍照并保存。33 上海交通大学2012级博士学位论文2.2.2.2.3PCR产物胶回收、纯化采用美国OMEGA公司的胶回收试剂盒。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤如下：(1)在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来。并尽量去除多余的凝胶；注：DNA在紫外灯下的曝光的时间不要超过30s。(2)取新的1.5mL离心管，称取其重量，将切下带目的片段的凝胶放入离心管中，再称其重量，求出凝胶块的重量，近似地确定其体积；(3)加入与凝胶体积相等的BindingBuffer，将装有凝胶块的离心管置于55°C~65°C水浴中温浴6~10min至凝胶完全融化，其间每隔2~3min混匀一次；(4)转移700μL的DNA-琼脂糖溶液到HiBindDNA结合柱中，室温10000g，离心1min，倒去收集管中的滤液；(5)将柱子重新装回收集管，加入300μLBindingBuffer，室温10000g，离心1min，倒去收集管中的滤液；(6)将柱子重新装回收集管，加入700μLSPWWashbuffer，室温10000g，离心1min，弃滤液；(7)重复步骤(6)一次；(8)将柱子重新装回收集管，室温10000g，离心2min，以甩干柱子基质；(9)将柱子装在1.5mL新离心管上，加入30~50μLElutionBuffer，静置1~2min，室温13000g，离心1min，离心管中洗脱出的溶液即纯化的DNA产物；(10)吸取1μL纯化的质粒DNA，用NP-2000超微量分光光度计检测质粒DNA样品浓度。2.2.2.2.4PCR产物转化、抽提及鉴定(1)PCR产物转化：方法同2.2.2.1.1；取1μL质粒加入到10μL感受态细胞中，冰上放置30min；42°C水浴锅内水浴90s，冰上放置5min；加入800μL不含抗生素的LB培养基，置于37°C摇床，150rpm摇菌1h；离心弃上清；加入100μL不含抗生素的LB培养基，轻轻吸打混34 上海交通大学2012级博士学位论文匀后，均匀地涂布于含100μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，倒置放入37°C细菌培养箱培养12~18h；在无菌状态下挑取单个菌落若干，分别加入4~5mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，置37°C摇床，200rpm摇菌12~18h。(2)质粒抽提：采用美国OMEGA公司的质粒小抽试剂盒。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤同2.2.2.1.2。(3)质粒酶切鉴定：方法同2.2.2.1.3；1)试剂准备：pEGFP-N1-TFEB质粒，NotI，NheI，10×Buffer，ddH2O。2)在1.5mLEP管内中依次加入以下试剂，反应体系如下：表4双酶切反应体系试剂组分体积或终浓度pEGFP-N1-TFEBK316R5.0μLNotI1.0μLNheI1.0μL10×Buffer5.0μLddH2O38μLTotal50μL3)反应条件：37°C水浴1h。4)酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像。配置1%琼脂糖凝胶，用移液器将50μL质粒双酶切样品小心加入点样孔中，在第一个点样孔中加入DNAMarker；于145V，电泳30min；待电泳结束，取出琼脂糖凝胶，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像，拍照并保存。5)经双酶切鉴定正确的pEGFP-N1-TFEBK316R质粒送上海生物工程技术有限35 上海交通大学2012级博士学位论文公司测序；6)经测序正确的质粒则进行质粒大抽。(4)质粒大抽采用美国Promega公司的胶回收试剂盒。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤如下：1)配置200mLLB液体培养基，方法同2.1.3.5。2)2g胰蛋白胨，2gNaCl，1g酵母提取物，ddH2O充分溶解后，定容至200mL，经高温高压灭菌后，4°C保存备用。3)收菌：将所保有的测序正确的质粒菌液3~5mL加至含卡纳霉素的LB培养基，于37°C，以200rpm，振摇12~16h，结束前确定菌液是否摇混；4)离心：将过夜培养的200mL菌液分别转移至50mL灭菌的离心管内，于4°C，以4000rpm，离心10min，弃上清液；5)重悬：吸取10mL预先加入RNase的BufferRES(4°C保存)重悬细菌沉淀，置于震荡仪震荡并用枪头吸打充分混匀，确保沉淀完全散开，无可见细菌团块；6)裂解：吸取10mL的BufferLYS加至重悬的细菌悬液内(使细菌基因组破裂，蛋白变性)，轻轻上下颠倒充分混匀，室温静置5min，可见白色絮状物产生；7)平衡：将滤芯插入柱子，将柱子驾于50mL离心管上，吸取适量的BufferEQU沿滤芯四周加入以充分平衡滤芯；8)离心：吸取10mL的BufferNEU，上下颠倒充分混匀，于4°C，10000rpm，离心10min；9)过滤：离心结束后，将上清缓慢沿倒至纯化柱内，底部用15mL离心管接滤过液；10)中和：过滤结束后，吸取5mL的BufferEQU，再洗涤一遍柱子，弃滤纸；11)洗涤：吸取10mL的WashBuffer洗纯化柱1~2次；12)洗脱：吸取5mL的BufferELU将质粒洗脱至15mL离心管中；13)沉淀：配置0.7倍体积的异丙醇5mL，待BufferELU滤完，吸取5mL异36 上海交通大学2012级博士学位论文丙醇加至离心管中，上下颠倒混匀，静置10min后，于4°C，13000rpm，离心30min，吸弃上清；14)洗涤：配置70%乙醇5mL，加至离心管中，洗涤质粒，于4°C，13000rpm，离心5min，小心吸弃上清，重复此步骤3遍；15)空离1次，小心地吸弃上清液，尽量吸净；16)取800-1000μLElutionBuffer溶解质粒，吸取1μL质粒，用NP-2000超微量分光光度计检测质粒DNA样品浓度。2.2.3细胞转染及质粒表达鉴定2.2.3.1细胞转染(1)将HEK293T细胞用DMEM高糖完全培养基培养于37°C细胞培养箱，隔天更换培养液，每3d按照1:3比例进行传代；(2)转染前一天，选择对数生长期的细胞，经胰酶消化后，以每孔105~106个细胞接种于6孔板，培养过夜，待细胞密度达到60~70%时进行细胞转染；(3)转染前2h将6孔板细胞中的完全培养液换成不含血清和抗生素的Opti-MEM培养基；(4)于超净工作台中取1.5mL无菌的EP管，分别将2μg质粒(pEGFP-N1-TFEB或pEGFP-N1-TFEBK316R)和4μLLipofectamine2000加到250μL不含血清和抗生素的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min；(5)将EP管中质粒-Lipofectamine2000混合液加至6孔板细胞中，轻轻混匀；(6)培养4~6h后，吸弃孔中含有质粒-Lipofectamine2000混合液的培养基，更换为新鲜的完全培养基，置于37°C的细胞培养箱中继续培养48h。(7)转染效率评估：在转染12h时，在倒置荧光显微镜下观察GFP的绿色荧光，并计算发荧光的细胞数量，除以普通光学显微镜下相同视野的细胞数量，即得到转染效率。计算公式如下：转染效率=发荧光细胞数量/相同视野的细胞数量×100%2.2.3.2Westernbolt检测质粒表达2.2.3.2.1细胞蛋白提取37 上海交通大学2012级博士学位论文(1)在转染48h后，PBS清洗6孔板细胞2~3次，1×SDSSampleBuffer收取细胞总蛋白，35%超声3次降低黏度；(2)瞬时离心，置于煮样器，100°C煮5~10min，使蛋白充分变性；(3)煮样结束后，瞬离样品使管壁和管盖上的水汽沉至管底，12000rpm离心5min后待上样。2.2.3.2.2配置SDS-聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)(1)取1.5cm的电泳玻璃板，用洗涤液将其清洗，再用ddH2O冲洗干净，确保玻璃板的洁净，并安装好玻璃板；(2)配置10%的分离胶：下层10%分离胶(10mL)配置方法见实验材料部分2.1.3.7；(3)在两玻璃板的间隙中迅速灌注分离胶溶液，留出2~3cm浓缩胶所需的空间。在分离胶溶液上面覆盖一层水，室温放置约25~30min；(4)待分离胶完全凝固后，吸弃上层水，用滤纸吸净残留液体；(5)配置6%的浓缩胶：上层浓缩胶(6mL)配置方法见实验材料部分2.1.3.8；(6)在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，并立即插入1.5cm点样梳，室温放置30min。2.2.3.2.3SDS-PAGE电泳(1)点样：用移液器将样品缓缓加到凝胶孔底部，第一个孔加等体积的蛋白Maker；(2)电泳：将电泳槽与稳压直流电源的正负极正确相连，使电泳在恒压状态下进行，起始电压为80~90V，待溴酚蓝指示线移过浓缩胶后，调整电压至120~150V；待指示线移到凝胶底部时，可视情况停止电泳。2.2.3.2.4转膜(1)提前配好转膜缓冲液并放置4°C冰箱预冷；(2)预先裁剪与凝胶尺寸大小合适的PVDF膜（孔径为0.45μm），浸泡于甲醇2~5min，使其活化；(3)将凝胶取出，切取含目的条带的胶条，置于盛有转膜转移缓冲液的玻璃槽中；38 上海交通大学2012级博士学位论文(4)采用湿法电转移的方法转膜，按照海绵、凝胶、PVDF膜、海绵（从下至上的顺序）的原则，驱除留于膜上的气泡，用夹板将它们固定好，插入转膜槽（注意正反顺序）；(5)将预先预冷的转膜缓冲液加入转膜槽，盖上盖子通电转膜。转膜持续的时间：恒流220mA1.5h。2.2.3.2.5封闭(1)电转完毕后，将取下的PVDF膜做好标记，TBST漂洗一次，以冲洗掉残留的转膜缓冲液和甲醇；(2)将PVDF膜置于5%的脱脂奶粉中，在要床上室温封闭1h。2.2.3.2.6抗体孵育(1)一抗与靶蛋白的结合1)将封闭后的PVDF膜取出，TBST缓冲液漂洗3次，每次5~10min；2)加入一抗：TBST缓冲液1mL，加入兔抗TFEB单克隆抗体0.5μL，使体积比为1:2000；TBST缓冲液1μL，同时加入小鼠抗β-actin单克隆抗体0.5μL，使体积比为1：2000；4°C孵育过夜。(2)酶标记二抗与一抗的结合1)弃去一抗，TBST缓冲液漂洗3次，每次5~10min；2)加入二抗：TBST缓冲液1mL，加入各个抗体对应的二抗，使体积比为1：5000；室温下孵育1~2h。注意保证膜的所有部分同溶液接触。2.2.3.2.7显色和图像分析(1)弃去二抗，TBST缓冲液漂洗3次，每次5~10min；(2)将PVDF膜平铺于扫描板上，将ECL显影液A、B按1:1混合，加适量的显影液于膜上，刚好覆盖整张膜，避免气泡的产生；(3)采用LAS-4000凝胶成像系统进行显像分析，免疫印迹图像分析采用ImageJ(NIH)的灰度分析方法，即以TFEB蛋白条带与内参β-actin条带的灰度值的比值作为TFEB蛋白的相对含量。39 上海交通大学2012级博士学位论文2.2.4免疫沉淀法检测TFEB的SUMO化修饰水平[82]2.2.4.1外源性SUMO实验2.2.4.1.1免疫共沉淀法证实TFEB与SUMO-1结合(1)细胞转染：取对数生长期的HEK293T细胞，以每孔105~106个细胞接种于6孔板，待细胞密度达60%~80%时利用Lipofectamine2000试剂将下列各组质粒转染至HEK293T细胞，转染方法同2.2.3.1：组①：质粒pEGFP-N1-TFEB和pCDNA3.1共转染HEK293T细胞；组②：质粒pEGFP-N1-TFEB、HA-Ubc9和pCDNA3.1共转染HEK293T细胞；组③：质粒pEGFP-N1-TFEB、HA-Ubc9和FLAG-SUMO-1共转染HEK293T细胞；组④：质粒pEGFP-N1-TFEB和FLAG-SUMO-1共转染HEK293T细胞。(2)细胞准备：待转染48h，吸弃原培养基，先用预冷的PBS漂洗1~2次；再将细胞收集至EP管中，800g离心5min去上清；(3)裂解液配置：配置RIPAbuffer（配置方法见2.1.3.15），裂解细胞前临时加入各种蛋白酶抑制剂(1:1000)和PMSF(1:100)，冰上操作；(4)裂解细胞：加入500μLRIPABuffer至各EP管中，置于4°C摇床裂解30min；(5)离心：4°C，13000rpm离心15min，将上清转移至新的EP管中；(6)孵育：取1/10细胞裂解液并加入2×SDS-loadingbuffer作为WCL(wholecelllysate)检测，其余裂解液中加入10~15μLFLAG-M2抗体，置于4°C静音混合器孵育1~2h；(7)收集beads：孵育结束后，瞬离至6000rpm，然后将EP管180度旋转再瞬离至6000rpm，小心吸弃上清液，保留沉积于管底的beads；(8)漂洗beads：再加入0.5~1mLRIPAbuffer(150~400mMNaCl)，置于4°C静音混合器漂洗10min，重复漂洗3次；(9)清除残留缓冲液：吸弃上清液，用胰岛素针插入EP管底部迅速将残留的缓冲40 上海交通大学2012级博士学位论文液吸净；(10)加入30-50μL2×SDS-loadingbuffer，100°C煮样10min；(11)Westernblot分析各组细胞TFEB的SUMO化水平。方法同2.2.3.2。配置10%SDS-聚丙稀酰胺凝胶，按照input（组①，组②，组③，组④）、IP（组①，组②，组③，组④）的顺序点样，起始80~90V恒压电泳，待溴酚蓝指示线移过浓缩胶后，调整电压至120~150V；待指示线移到凝胶底部时，停止电泳；采用湿法电转移的方法，恒流220mA1.5h转膜；电转完毕后，将PVDF膜取出，置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1h；一抗Flag(1:5000)、TFEB(1:2000)4°C孵育过夜；二抗(1:5000)室温下孵育1h。弃去二抗，TBST缓冲液漂洗后进行显色和图像分析。2.2.4.1.2免疫共沉淀法证实TFEB的SUMO化修饰位点(1)取对数生长期的HEK293T细胞，以每孔105~106个细胞接种于6孔板，待细胞密度达60%~80%时利用Lipofectamine2000试剂将下列各组质粒转染至HEK293T细胞，转染方法同2.2.3.1：组①：质粒pEGFP-N1-TFEB和pCDNA3.1共转染HEK293T细胞；组②：质粒pEGFP-N1-TFEBK316R和pCDNA3.1共转染HEK293T细胞；组③：质粒HA-Ubc9和FLAG-SUMO-1共转染HEK293T细胞；组④：质粒pEGFP-N1-TFEB、HA-Ubc9和FLAG-SUMO-1共转染HEK293T细胞；组⑤：质粒pEGFP-N1-TFEBK316R、HA-Ubc9和FLAG-SUMO-1共转染HEK293T细胞；(2)收集并裂解细胞：待转染48h，收集细胞，RIPAbuffer冰上充分裂解细胞；取1/10细胞裂解液并加入2×SDS-loadingbuffer作为WCL检测，其余裂解液中加入10~15μLFLAG-M2抗体，置于4°C静音混合器孵育1~2h；(3)收集并漂洗beads：孵育结束后，按照上述方法见2.2.4.1.1(8)漂洗beads，并清除残留缓冲液；(4)加入30-50μL2×SDS-loadingbuffer，100°C煮样10min；41 上海交通大学2012级博士学位论文(5)Westernblot分析各组细胞TFEB的SUMO化修饰水平。方法同2.2.3.2。配置10%SDS-聚丙稀酰胺凝胶，按照input（组①，组②，组③，组④）、IP（组①，组②，组③，组④）的顺序点样，起始80~90V恒压电泳，待溴酚蓝指示线移过浓缩胶后，调整电压至120~150V；待指示线移到凝胶底部时，停止电泳；采用湿法电转移的方法，恒流220mA1.5h转膜；电转完毕后，将PVDF膜取出，置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1h；一抗Flag(1:5000)、TFEB(1:2000)4°C孵育过夜；兔二抗(1:5000)室温下孵育1h。弃去二抗，TBST缓冲液漂洗后进行显色和图像分析。2.2.4.2内源性SUMO实验2.2.4.2.1免疫共沉淀法检测巨噬细胞内TFEB的SUMO化修饰水平(1)细胞准备：取处于对数生长期的THP-1单核细胞，培养于含160nMPMA的RPMI1640完全培养基72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；注：细胞由悬浮状态变为贴壁状态，形态由圆形变为梭形或不规则形状态，提示单核细胞分化为巨噬细胞。(2)吸弃原培养基，先用预冷的PBS漂洗1~2次；收集细胞至EP管中，800g,离心5min去上清；(3)裂解液配置：配置RIPAbuffer（配置方法见2.1.3.15），裂解细胞前临时加入各种蛋白酶抑制剂(1:1000)和PMSF(1:100)，冰上操作；(4)裂解细胞：加入500μLRIPABuffer至各EP管中，置于4°C静音混合器裂解30min；(5)离心：4°C，13000rpm，离心15min，将上清转移至新的EP管中；(6)孵育：取1/10细胞裂解液并加入2×SDS-loadingbuffer作为WCL检测，其余裂解液中加入2~3μLSUMO-1抗体及15~30μLProteinA/Gbeads，置于4°C静音混合器孵育过夜；(7)收集beads：孵育结束后，瞬离至6000rpm，然后将EP管180度旋转再瞬离至6000rpm，小心吸弃上清液，保留沉积于管底的beads；(8)漂洗beads：再加入0.5~1mLRIPAbuffer(150~400mMNaCl)，置于4°C静42 上海交通大学2012级博士学位论文音混合器漂洗10min，重复漂洗3次；(9)清除残留缓冲液：吸弃上清液，用胰岛素针插入EP管底部迅速将残留的缓冲液吸净；(10)加入30-50μL2×SDS-loadingbuffer，100°C煮样10min；(11)Westernblot分析THP-1巨噬细胞内TFEB的SUMO化修饰水平。方法同2.2.3.2.2。配置10%SDS-聚丙稀酰胺凝胶，按照input、IP的顺序点样，起始80~90V恒压电泳，待溴酚蓝指示线移过浓缩胶后，调整电压至120~150V；待指示线移到凝胶底部时，停止电泳；采用湿法电转移的方法，恒流220mA1.5h转膜；电转完毕后，将PVDF膜取出，置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1h；一抗SUMO-1(1:2000)、TFEB(1:2000)4°C孵育过夜；兔二抗(1:5000)室温下孵育1h。弃去二抗，TBST缓冲液漂洗后进行显色和图像分析。2.2.4.2.2免疫共沉淀法检测在巨噬泡沫细胞形成过程中TFEB的SUMO化修饰水平的变化(1)建立巨噬泡沫细胞模型1)将各组稳转THP-1单核细胞株用1640完全培养基培养于37°C细胞培养箱，隔天传代，更换新鲜培养液；2)800g离心5min后，将各组细胞以每孔约1×105个细胞接种至6孔板中的两个孔，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；3)吸弃含PMA的培养基，加入新鲜1640完全培养基与ox-LDL(终浓度为50μg/mL)共同孵育24h，使之转变为巨噬泡沫细胞。(2)免疫共沉淀法检测各组巨噬细胞内TFEB的SUMO化修饰水平1)实验分组：对照组（NC组）THP-1巨噬细胞培养在1640完全培养基；实验组（ox-LDL组）巨噬细胞培养在含有50μg/mLox-LDL的1640完全培养基，共孵育24h，使之转变为巨噬泡沫细胞。43 上海交通大学2012级博士学位论文2)收集各组巨噬细胞，RIPA裂解细胞，离心后取1/10细胞裂解液并加入2×SDS-loadingbuffer作为WCL检测，其余裂解液中加入2~3μLSUMO-1抗体及15~30μLProteinA/Gbeads，置于4°C静音混合器孵育过夜；收集并漂洗beads，清除残留缓冲液，加入30-50μL2×SDS-loadingbuffer，100°C煮样10min；3)Westernblot分析THP-1巨噬细胞内TFEB的SUMO化水平。配置10%SDS-聚丙稀酰胺凝胶，按照input（NC组，ox-LDL组）、IP（NC组，ox-LDL组）的顺序点样，起始80~90V恒压电泳，待溴酚蓝指示线移过浓缩胶后，调整电压至120~150V；待指示线移到凝胶底部时，停止电泳；采用湿法电转移的方法，恒流220mA1.5h转膜；电转完毕后，将PVDF膜取出，置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1h；一抗SUMO-1(1:2000)、TFEB(1:2000)4°C孵育过夜；兔二抗(1:5000)室温下孵育1h。弃去二抗，TBST缓冲液漂洗后进行显色和图像分析。2.2.5TFEBSUMO位点突变的THP-1稳定细胞系的构建2.2.5.1慢病毒载体质粒的构建载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒与pEGFP-N1-TFEB/TFEBK316R质粒MCS区有共同的酶切位点NotI和NheI（见图3），因此双酶切两种质粒分别获取载体大片段及TFEB/TFEBK316R目的片段，再将载体大片段和目的片段连接即可构成pCDH-TFEB/TFEBK316R慢病毒载体质粒。2.2.5.1.1双酶切反应(1)试剂准备：pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒，pEGFP-N1-TFEB/TFEBK316R，NotI，NheI，10×Buffer，ddH2O。(2)在1.5mLEP管内中依次加入以下试剂，反应体系如下：44 上海交通大学2012级博士学位论文表5载体双酶切反应体系试剂组分体积或终浓度pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP5.0μLNotI1.0μLNheI1.0μL10×Buffer5.0μLddH2O38μLTotal50μL表6质粒双酶切反应体系试剂组分体积或终浓度pEGFP-N1-TFEB/TFEBK316R5.0μLNotI1.0μLNheI1.0μL10×Buffer5.0μLddH2O38μLTotal50μL(3)反应条件：37°C水浴1h；(4)酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像；1)将各质粒的酶切产物上样，1%琼脂糖凝胶电泳跑胶，稳压145V，电泳30min。方法同2.2.2.1.3(4)。2)观察PCR产物条带，待电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像，拍照并保存。45 上海交通大学2012级博士学位论文2.2.5.1.2酶切产物胶回收：在紫外灯下切割所需的DNA片段，采用美国OMEGA公司的胶回收试剂盒。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤同2.2.2.2.3。2.2.5.1.3载体与目的片段连接采用日本Takara公司的T4Ligase体系。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤如下：(1)试剂准备：回收的载体与目的片段、T4LigaseMix(SolutionI)、ddH2O。(2)在1.5mlEP管内中配制以下反应液，反应体系如下：表7连接反应体系试剂组分体积或终浓度回收的载体片段1μL回收的目的片段3μLSolutionI4μLTotal8μL注：载体与片段的比例最好控制在1:3~1:6之间。(3)反应条件：16°C连接1h。2.2.5.1.4转化与涂板：方法同2.2.2.1.1。取5μL链接产物加入到50μL感受态细胞中，冰上放置30min；42°C水浴锅内水浴90s，冰上放置5min；加入800μL不含抗生素的LB培养基，置于37°C摇床，150rpm摇菌1h；离心弃上清；加入100μL不含抗生素的LB培养基，轻轻吸打混匀后，均匀地涂布于含100μg/mL氨苄霉素的固体LB平板上，倒置放入37°C细菌培养箱培养12~18h；在无菌状态下挑取单个菌落若干，分别加入4~5mL含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基，置37°C摇床，200rpm摇菌12~18h。46 上海交通大学2012级博士学位论文2.2.5.1.5质粒抽提：采用美国OMEGA公司的质粒小抽试剂盒。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤同2.2.2.1.2。2.2.5.1.6质粒酶切鉴定：1)试剂准备：pEGFP-N1-TFEB质粒，NotI，NheI，10×Buffer，ddH2O。在1.5mLEP管内中依次加入以下试剂，反应体系如下：表8酶切反应体系试剂组分体积或终浓度pCDH-TFEB/TFEBK316R2.0μLNotI0.5μLNheI0.5μL10×Buffer2.0μLddH2O15μLTotal20μL2)反应条件：37°C水浴1h。3)酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像。4)配置1%琼脂糖凝胶，用移液器将20μL质粒双酶切样品小心加入点样孔中，在第一个点样孔中加入DNAMarker；于145V，电泳30min；待电泳结束，取出琼脂糖凝胶，紫外灯下观察及凝胶扫描成像系统成像，拍照并保存。5)双酶切鉴定正确的pCDH-TFEB/TFEBK316R质粒送上海生物工程技术有限公司测序。2.2.5.1.7细胞转染及质粒表达鉴定：取对数生长期的HEK293T细胞，胰酶消化后均匀接种在6孔板中，待细胞密度达60%~80%时利用Lipofectamine2000试剂分别将2μgpCDH-TFEB或TFEBK316R分别转入细胞，转染后48h，提取细胞蛋白，Westernbolt检测各组质粒表达，47 上海交通大学2012级博士学位论文方法同2.2.3.2。2.2.5.2慢病毒的包装2.2.5.2.1细胞转染(1)取对数生长期的HEK293T细胞，胰酶消化后均匀接种在3个10cm培养皿中，待细胞密度达60%~80%时利用Lipofectamine2000试剂将如下各组质粒进行转染，转染方法同2.3.1；组①：pCDH-voctor、PMD2G和PSPAX2共转染HEK293T细胞；组②：pCDH-TFEB、PMD2G和PSPAX2共转染HEK293T细胞；组③：pCDH-TFEBK316R、PMD2G和PSPAX2共转染HEK293T细胞；注：细胞状态对于病毒包装至关重要，因此要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。(2)转染前2h将完全培养液换成不含血清和抗生素的Opti-MEM培养基；(3)将慢病毒载体pCDH-voctor/pCDH-TFEB/pCDH-TFEBK316R(10μg)连同包装质粒PMD2G(3μg)和PSPAX2(1μg)共转入HEK293T细胞中；转染方法同2.2.3.1。(4)转染后6~8h换液，吸弃孔中含有质粒-Lipofectamine2000混合液的培养基，再加入10~15mL新鲜的DMEM高糖培养基，置于37°C细胞培养箱中继续培养48h。2.2.5.2.2病毒收集及浓缩(1)转染后48h，分别将培养基(含病毒颗粒)小心吸至3个15mL无菌离心管中，并做好标记；(2)4°C，3000rpm离心10min后，上清液再用0.45μm滤器过滤，充分去除培养基中的细胞残渣和杂质后，得到病毒初液，三种重组病毒为：Lenti-con、Lenti-TFEB和Lenti-TFEBK316R。(3)4°C，25000rpm超速离心90min，弃去上清，加入病毒原液体积1%的PBS缓冲液，每隔15min用移液器轻轻吹打一次，重悬慢病毒颗粒，重复操作5~8次，使病毒颗粒彻底悬浮。(4)分装100μL/管，-80°C冻存备用。48 上海交通大学2012级博士学位论文2.2.5.2.3慢病毒滴度测定（梯度稀释法）(1)测定前一天，取对数生长期的HEK293T细胞，胰酶消化后，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，体积为100μL，培养基使用无血清培养基；(2)准备10个无菌的EP管，每管加入90μL的无血清清培养基；(3)取10μL待测定的病毒原液加入到第一个EP管中，轻轻并充分混匀后，取10μL加入到第二个EP管中。依次做梯度稀释，继续相同的操作直到最后一个EP管；(4)吸弃细胞孔中90μL原培养基，依次加入90μL稀释好的病毒液，放入细胞培养箱孵育过夜；(5)24h后，加入完全培养基100μL；(6)96h后，在倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况。(7)根据GFP表达情况，计算病毒滴度=X×l0(Y+1)IFU/mL（X代表最后出现荧光的孔内荧光数量；Y代表最后出现荧光的孔内病毒稀释梯度值）。2.2.5.2.4确定筛选药物剂量(1)取对数生长期的THP-1单核细胞，800g离心5min后，以每孔约1×105个细胞接种至24孔板；(2)分别用含终浓度为0.5~10μg/mL（连续两孔之间浓度差为0.5μg/ml）嘌呤霉素的培养基培养THP-1单核细胞，设立阴性对照，做好编号标记后，置于细胞培养箱培养；(3)连续镜下观察7d，以3d能杀死全部THP-1单核细胞的嘌呤霉素作为续筛选浓度，确定筛选稳转细胞系的嘌呤霉素浓度为3μg/mL。2.2.5.2.5慢病毒感染细胞(1)取对数生长期的THP-1单核细胞，800g离心5min后，以每孔约1×105个细胞接种至6孔板中的四个孔，即可用于感染；(2)实验设置4组，分别为空白组、阴性对照组、过表达TFEB组和过表达TFEBK316R组，根据细胞感染复数(multiplicityofinfection,MOI)值，加入相应量49 上海交通大学2012级博士学位论文的病毒（见表9）和2μLPolybrene（终浓度8μg/mL）；表9细胞慢病毒感染实验分组和病毒用量病毒序号实验分组标记病毒滴度(TU/mL)病毒用量(mL)NC空白组2×1072Lenti-con阴性对照组2×1072Lenti-TFEB过表达TFEB组2×1072Lenti-TFEBK316R过表达TFEBK316R组2×1072(3)32°C，1200g离心2h，置于细胞培养箱继续培养48h；(4)800g离心5min后，吸弃病毒液，换用新鲜1640完全培养基培养。若感染成功，约48h后即可看到较强的绿色荧光。2.2.5.2.6稳转细胞株的筛选(1)按照预先检测出的嘌呤霉素的筛选浓度，将各组稳转株培养在嘌呤霉素终浓度为3μg/mL的1640完全培养基中，筛选7d；(2)600g离心5min，去除嘌呤霉素杀死的细胞。剩余细胞更换为新鲜1640完全培养基，在细胞培养箱中继续培养。2.2.5.2.7稳转细胞株的鉴定(1)将稳转THP-1单核细胞株用1640完全培养基培养于37°C细胞培养箱，隔天离心传代，更换新鲜培养液；(2)800g离心5min，将稳转THP-1单核细胞株培养于含160nMPMA的1640完全培养基72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；(3)Westernblot检测各组稳转巨噬细胞株TFEB蛋白表达量。方法同2.2.3.2。(4)Real-timePCR检测各组稳转巨噬细胞株TFEBmRNA表达量。方法同2.2.6.5。50 上海交通大学2012级博士学位论文2.2.6检测TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞自噬溶酶体生成的影响2.2.6.1透射电镜观察各组稳转株溶酶体及自噬的生成情况[83](1)细胞准备：取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于10cm培养皿中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；实验分组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组(2)收集细胞：用无菌的细胞刮将各组巨噬细胞刮下分别分装到3个15mL无菌离心管中，800g离心5min，使细胞沉于管底；(3)前固定：吸弃上清，加入2.5%戊二醛溶液10mL，4°C固定2~3h；(4)漂洗：用1MPBS(PH7.2)冲洗3次，每次15min；(5)后固定：用1%锇酸，4°C固定细胞1~2h；(6)漂洗：用1MPBS(PH7.2)冲洗3次，每次15min；(7)脱水：丙酮系列将细胞脱水。室温下，丙酮从低浓度到高浓度(30%、50%、70%、80%、90%)每个浓度作用15~20min，纯丙酮在作用3次，每次作用30min；(8)包埋：环氧树脂包埋，65°C~70°C烤箱聚合24h；(9)超薄切片：超薄切片机切出厚度小于100nm切片；(10)染色：3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色(11)透射电镜JEOLJEM-1230(80KV)观察，拍片。在多种检测自噬的众多方法中，透射电镜下超微结构的形态学检测为检测自噬体的金标准。自噬体(Autophagosome)的特点是由双层膜包裹的未被消化或者降解的胞浆成分，如内质网、线粒体、核糖体等；电镜下观察到自噬体是自噬发生的最有力的证据。自噬溶酶体(Autolysosome)的特点为是单层膜包裹的已被消化或者降解的胞浆成分。溶酶体(Lysosome)的特点是高密度的单层膜包被的囊泡结构。2.2.6.2免疫荧光观察各组稳转株溶酶体和自噬的生成情况LC3和LAMP1分别是自噬和溶酶体生成的标志，因此，我们观察各组稳转株给予ox-LDL处理24h前后，LC3和LAMP1的表达情况。(1)实验分组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组51 上海交通大学2012级博士学位论文(2)细胞爬片：取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于预先铺好无菌盖玻片的6孔培养板中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；(3)固定：吸弃培养基，PBS漂洗1~2次，加入预冷的4%多聚甲醛固定10~15min；(4)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min，以清洗残余的多聚甲醛；(5)透化：加入0.5%TritonX-100处理5min，PBS漂洗2~3次，每次5min；(6)封闭：加1%BSA室温封闭1h；(7)孵育一抗：于切片上滴加已用1%BSA稀释的一抗（稀释比例为1:200），100~150μL/片，放在湿盒中，4°C孵育过夜；(8)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(9)孵育二抗：于切片上滴加已用1%BSA稀释的荧光标记的二抗（稀释比例为1:5000），100~150μL/片，湿盒内室温避光孵育1h；(10)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(11)染细胞核：配置DAPI工作液，DAPI储存液:ddH2O=1:1000；于切片上滴加DAPI工作液，100~150μL/片，室温避光染色约5min；(12)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(13)封片：用抗荧光淬灭剂滴加到载玻片，用盖玻片封片；(14)激光共聚焦显微镜下观察，拍照。2.2.6.3Westernblot检测各组稳转株LC3和LAMP1的表达情况(1)实验分组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组(2)取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于6孔培养板中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；(3)细胞蛋白提取：方法同2.2.3.2.1。PBS清洗细胞，1×SDSSampleBuffer收取细胞总蛋白，超声3次降低黏度；置于煮样器，100°C煮5~10min，使蛋白充分变性；煮样结束后，瞬离样品使管壁和管盖52 上海交通大学2012级博士学位论文上的水汽沉至管底，12000rpm离心5min后待上样。(4)配置SDS-聚丙稀酰胺凝胶：1)配置15%的分离胶，配置方法见实验材料部分2.1.3.7；2)配置6%的浓缩胶：上层浓缩胶(6mL)配置方法见实验材料部分2.1.3.8；3)清洗并安装好玻璃板，在两玻璃板的间隙中迅速灌注分离胶溶液，留出2~3cm浓缩胶所需的空间。在分离胶溶液上面覆盖一层水，室温放置约25~30min；待分离胶完全凝固后，吸弃上层水，用滤纸吸净残留液体；在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，并立即插入1.5cm点样梳，室温放置30min。(5)SDS-PAGE电泳：1)点样：用移液器将样品按照组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组的顺序缓缓加到凝胶孔底部，第一个孔加等体积的蛋白Maker；2)电泳：将电泳槽与稳压直流电源的正负极正确相连，起始电压为恒压80~90V，待溴酚蓝指示线移过浓缩胶后，调整电压至120~150V；待指示线移到凝胶底部时，可视情况停止电泳。注：LC3是14kd和16kd的小分子蛋白，待指示线移到凝胶中下部时，可停止电泳。(6)转膜：1)预先裁剪与凝胶尺寸大小合适的PVDF膜，浸泡于甲醇2~5min，使其活化；注：PVDF膜选用：LC3应选用孔径为0.22μm的PVDF膜；LAMP1应选用孔径为0.45μm的PVDF膜。2)将凝胶取出，切取含目的条带的胶条，置于盛有转膜转移缓冲液的玻璃槽中；3)采用湿法电转移的方法转膜；注：LC3转膜持续的时间：恒流180mA1h。LAMP1转膜持续的时间：恒流220mA1.5h。(7)封闭：将PVDF膜置于5%的脱脂奶粉中室温封闭1h。(8)抗体孵育：1)将封闭后的PVDF膜取出，TBST缓冲液漂洗3次，加入一抗：兔抗LC3单53 上海交通大学2012级博士学位论文克隆抗体(1:2000)；兔抗LAMP1单克隆抗体(1:2000)；小鼠抗β-actin单克隆抗体(1:2000)；4°C孵育过夜。2)弃去一抗，TBST缓冲液漂洗3次，分别加入二抗：兔二抗(1:5000)，鼠二抗(1:5000)；室温下孵育1~2h。注意保证膜的所有部分同溶液接触。(9)显色和图像分析：1)弃去二抗，TBST缓冲液漂洗3次，每次5~10min；2)将PVDF膜平铺于扫描板上，将ECL显影液A、B按1:1混合，加适量的显影液于膜上，刚好覆盖整张膜，避免气泡的产生；3)采用LAS-4000凝胶成像系统进行显像分析，免疫印迹图像分析采用ImageJ(NIH)的灰度分析方法，即以TFEB蛋白条带与内参β-actin条带的灰度值的比值作为TFEB蛋白的相对含量。2.2.6.4LysoTrackerRed染色观察各组稳转株溶酶体生成情况(1)实验分组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组(2)取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于激光共聚焦专用的玻底培养皿中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；(3)配制Lyso-TrackerRed染色工作液：将LysoTrackerRed按照1:20000的比例加至细胞培养基中（例如取1μLLyso-TrackerRed加入到20mL细胞培养基）；(4)染色：吸弃培养液，加入步骤(3)配制好的（37°C预温育）Lyso-TrackerRed染色工作液，与细胞37°C共孵育30min；(5)吸弃含有Lyso-TrackerRed染色工作液的培养基，加入新鲜的细胞培养基；(6)激光共聚焦显微镜下观察，拍照。2.2.6.5qRT-PCR检测各组稳转株溶酶体和自噬相关基因的表达情况2.2.6.5.1总RNA提取：按照TRIzol说明书进行(1)所有用于RNA提取的EP管、移液枪头均用0.1%DEPC水浸泡过夜，高压灭菌备用。(2)实验分组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组54 上海交通大学2012级博士学位论文(3)取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于6cm培养皿中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；(4)PBS漂洗1~2次；(5)各培养皿中加入1mLTrizol，室温静置5min，待细胞充分裂解后，收集于EP管中；(6)12000g，4°C离心10min，将上清液移入新的EP管中；(7)加入200μL氯仿至离心管，颠倒混匀后，室温静置5min；(8)12000g，4°C离心15min后，从离心机中小心取出EP管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新EP中（切忌吸出白色中间层）；(9)加入500μL的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀后，室温静置10min；(10)12000g，4°C离心10min；注：一般在离心后，试管底部会出现RNA沉淀。(11)弃去上清液，缓慢地沿EP管壁加入lmL75%的乙醇（切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒，使沉淀悬浮；(12)12000g，4°C离心5min后，小心弃去乙醇；(13)室温放置5min，使沉淀干燥至半透明；(14)加入20μLDEPC水，吹打混匀，-80°C保存备用；(15)RNA纯度及浓度的测定：以DEPC水调零，取1μLRNA，加入49μL的DEPC水，充分混匀，应用ND-2000仪器测定RNA的浓度和OD260/280值。2.2.6.5.2逆转录反应：参照TakaraAMV逆转录试剂盒说明书进行(1)试剂准备：RNA样品、AMVReverseTranscriptase、RnaseInhibitor、dNTPMix、5×AMVBuffer、RandomPrimer、DEPC水。(2)将上述试剂混匀离心后，在预冷Rnase-freeEP管内依次加入以下试剂（冰上操作）进行cDNA的制备：55 上海交通大学2012级博士学位论文表10逆转录反应体系试剂组分体积或终浓度TotalRNA2μgAMVReverseTranscriptase1μLRandomPrimer(9mer)1μLRnaseInhibitor0.5μLdNTPMix2μL5×AMVBuffer4μLDEPC水补至总体积20μLTotal20μL(3)反应条件：混匀上述试剂，短暂离心后，室温放置10min，然后移入PCR仪，在42°C反应60min，结束后行85°C灭活酶5min，即可得到反转录产物cDNA。2.2.6.5.3实时荧光定量PCR反应：参照ABI的SYBRGreenPCRMasterMix试剂盒说明书进行(1)试剂准备：逆转录产物(cDNA)、SYBRGreenPCRMasterMix、引物、ddH2O。荧光定量PCR引物由上海生物工程技术公司合成。具体如下：表11荧光定量PCR引物序列[60]基因引物序列正向5’-ACCATGTCAACATGAGTGAGC-3’LC3反向5’-CTGACAATTTCATCCCGAACG-3’上游5’-AGGTTGAGAAAGGCGAGACA-3’Becline1下游5’-AATTGTGAGGACACCCAAGC-3’上游5’-TCATCTTCAGCCACGCTGT-3’ULK1下游5’-CACGGTGCTGGAACATCTC-3’56 上海交通大学2012级博士学位论文上游5’-GCACTGACTGAGACGACTCCT-3’ATG9B下游5’-TAGTGCTCGGACTCTTGACG-3’上游5’-ACGTTACAGCGTCCAGCTCAT-3’LAMP1下游5’-TCTTTGGAGCTCGCATTGG-3’上游5’-CAGGCTTTGGTCTTCTCTCCA-3’CTSB下游5’-TCACGCATTCCAGGTCTTTG-3’上游5’-TGATCTCCACGTTCACCCTGA-3’CLCN7下游5’-TCTCCGAGTCAAACCTTCCGA-3’上游5’-GGAAGTGTCAGATGATCCCCA-3’ATP6V1A下游5’-CCGTTTGCCTCGTGGATAAT-3’上游5’-CCAGAAGCGAGAGCTCACAGAT-3’TFEB下游5’-TGTGATTGTCTTTCTTCTGCCG-3’上游5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’GAPDH下游5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’(2)将上述试剂混匀离心，在预冷反应管内依次加入以下试剂（冰上操作）：表12PCR反应体系试剂组分体积或终浓度SYBRGreenPCRMasterMix5μLsensePrimer(2μM)0.5μLantisensePrimer(2μM)0.5μLcDNA(diluted1:5-10)1μLddH2O3μLTotal10μL57 上海交通大学2012级博士学位论文(3)充分混匀上述反应液，添加至PCR管中，短暂离心以混匀试剂。(4)反应条件：50°C2min95°C5min95°C30s59°C30s15cycles72°C30s72°C10min4°CForever(5)数据分析：PCR扩增结束后，用溶解曲线和解离曲线分析扩增反应的特异性，实验重复3次。采用2-ΔΔCt相对定量法处理数据：求出每个样本的Ct值，以GAPDH为内参对照，计算目的基因的相对含量。△Ct=Ct目的基因-Ct内参△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组2-ΔΔCt=实验组较对照组的相对表达倍数2.2.6.6检测TFEB的SUMO化修饰对TFEB在细胞定位的影响2.2.6.6.1实验分组取生长状态良好的HeLa细胞，接种于预先铺好无菌盖玻片的6孔培养板中，待细胞密度达60%~80%时利用Lipofectamine2000试剂将下列各组质粒转染至HeLa细胞，转染方法同2.2.3.1：对照组：给予正常DMEM完全培养基培养；组①：质粒pEGFP-N1-TFEB；组②：质粒pEGFP-N1-TFEBK316R58 上海交通大学2012级博士学位论文实验组：给予HBSS培养基饥饿3h；组③：质粒pEGFP-N1-TFEBTFEB+HBSS组④：质粒pEGFP-N1-TFEBK316R+HBSS2.2.6.6.2荧光检测TFEB的SUMO化修饰对TFEB在细胞定位的影响(1)固定：吸弃培养基，PBS漂洗1~2次，加入预冷的4%多聚甲醛固定10~15min；(2)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min，以清洗残余的多聚甲醛；(3)染细胞核：配置DAPI工作液，DAPI储存液:ddH2O=1:1000；于切片上滴加DAPI工作液，100~150μL/片，室温避光染色约5min；(4)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(5)封片：用抗荧光淬灭剂滴加到载玻片，用盖玻片封片；(6)激光共聚焦显微镜下观察，拍照。2.2.6.6.3核质分离法检测TFEB的SUMO化修饰对其在细胞定位的影响(1)配置BufferA和BufferB裂解液，置于冰上。配制方法见(2)收集细胞：吸弃原培养基，用预冷的PBS漂洗1~2次；收集细胞至EP管中，800g,离心5min去上清；(3)细胞浆蛋白的提取：加入200μL的BufferA，吹打细胞使之完全悬浮并分散，置于冰上裂解15min，中间可用吸管吹打2~3次，促进裂解；随后向细胞悬液中加入10μL10%的TX-100，反复吹打后静置于冰浴中5min，4°C，5000rpm离心5min。立即吸取上清至一预冷的EP管中，即为细胞核蛋白；(4)细胞核蛋白的提取：将沉淀用BufferA洗3次，4°C，5000rpm离心5min。吸尽上清后，向沉淀中加入60μLBufferB，反复吹打后静置于冰浴中30min，4°C，14000rpm离心10min。上清即为细胞核蛋白；(5)Westernblot分别检测各组巨噬细胞细胞质和细胞核中TFEB的蛋白表达量。方法同2.2.3.2。59 上海交通大学2012级博士学位论文2.2.7检测TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞胆固醇含量的影响[84]2.2.7.1细胞脂质的抽提(1)细胞准备：取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于10cm培养皿中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞后，对照组：组①~③各组巨噬细胞培养在正常的1640完全培养基中，ox-LDL组：组④~⑥各组巨噬细胞培养在含50μg/mLox-LDL的1640完全培养基中24h；实验分组：对照组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组ox-LDL组：组④：NC组+ox-LDL；组⑤：TFEB组+ox-LDL；组⑥：TFEBK316R组+ox-LDL(2)吸弃培养基，PBS收集细胞至EP管中，加入1mL的脂质抽取液（氯仿:甲醇=2:1），漩涡混合器混匀1~2min，室温静置5~10min后，加100μLddH2O至EP管，10000g离心10min，小心吸取下层有机相至新的EP管中，真空干燥仪蒸干，备用；(3)剩余水相加入500μL0.1MNaOH，室温放置1~2h，并间断摇动，促进细胞裂解。取20μL用BCA法测定各组细胞蛋白含量。2.2.7.2细胞总胆固醇及游离胆固醇检测采用美国invitigene公司的AmplexRedcholesterolassaykit。该试剂盒的检测原理是：胆固醇酯酶分解胆固醇酯为游离胆固醇与脂肪酸，而后游离胆固醇被胆固醇氧化酶氧化，产生过氧化氢。在辣根过氧化物酶存在的条件下，过氧化氢与AmplexRed试剂反应，生成带有荧光resorufin，荧光酶标仪在560nm激发波长和590nm发射波长测得的相对荧光读数与胆固醇浓度成正比。具体方法和步骤如下：(1)配置胆固醇标准品：按照下表将2mg/mL的胆固醇溶于50μL1×ReactionBuffer，配制成0、2、4、6、8μg/mL的胆固醇溶液，依次加入96孔酶标板；60 上海交通大学2012级博士学位论文表13胆固醇标准品梯度配方表组分(μg/mL)024682mg/mL胆固醇(μL)00.10.20.30.41XReactionBuffer(μL)5050505050(2)分别将2.2.7.1第(2)步提取出的各组细胞胆固醇样品加入100μL1×ReactionBuffer，漩涡混合器混匀1min，使胆固醇完全溶解；(3)取50μL胆固醇样品依次加入96孔板，每个样本需作2个平行反应，分别为实验孔和对照孔；(4)实验孔加入50μL含有cholesterolesterase的AmplexRed反应液；对照孔只加入50μLAmplexRed反应液，轻轻摇动96孔板，使样品与试剂混匀，盖上盖子并密闭，37°C避光孵育30min；(5)即刻放进荧光分光光度计进行检测：以560nm激发光波长和590nm为发射波长，获得相对荧光读数；(6)构建标准曲线：以相对荧光值(Fluorescence)为纵座标，以标准胆固醇浓度(μg/mL)为横座标，画出标准曲线，根据标准曲线获得样品对应的胆固醇浓度。(7)计算样品中总胆固醇及游离胆固醇浓度：样品实际胆固醇浓度(μg/mL)=[样品对应胆固醇浓度(μg/mL)×样品稀释倍数]总胆固醇(μg/mL)=实验组所得荧光值计算所得的浓度游离胆固醇(μg/mL)=对照组所得荧光值计算所得的浓度2.2.7.3BCA法测定样本蛋白含量采用上海碧云天生物技术公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒。严格按照说明书所推荐的实验方法进行操作，具体方法和步骤如下：(1)蛋白标准品的准备：取1.2mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用或者-20°C61 上海交通大学2012级博士学位论文长期保存。(2)取适量蛋白标准溶液，用PBS稀释至终浓度为0.5mg/mL的溶液，分别取标准品0、1、2、4、8、12、16、20μL依次加到96孔板中，再加PBS补足到20μL；(3)配置BCA工作液：根据样品数量，按BCA试剂A体积:BCA试剂B体积=50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；(4)分别将2.2.7.1第(3)步提取出的20μL各组细胞蛋白样品依次加到96孔板的样品孔中，每个样本需作3个平行反应；(5)各孔再加入200μLBCA工作液，轻轻摇动96孔板，使样品与试剂混匀，盖上盖子并密闭，37°C放置20~30min；(6)用酶标仪检测各组细胞蛋白样本在595nm处的吸光值，用空白对照进行调零；(7)标准曲线的绘制：以样品的吸光值(OD)为纵座标，以标准蛋白浓度(mg/mL)为横座标，画出标准曲线，根据标准曲线获得样品对应的蛋白浓度。注：实际浓度浓度需要乘以样品的稀释倍数。2.2.7.4计算各组细胞内总胆固醇、游离胆固醇及胆固醇酯含量总胆固醇含量(μg/mg)=实验组所得荧光值计算所得的浓度(μg/mL)/蛋白浓度(mg/mL)游离胆固醇含量(μg/mg)=对照组所得荧光值计算所得的浓度(μg/mL)/蛋白浓度(mg/mL)胆固醇酯含量(μg/mg)=总胆固醇含量一游离胆固醇含量2.2.8检测TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞胆固醇流出的影响[55](1)实验分组：对照组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组ox-LDL组：组④：NC+ox-LDL组；组⑤：TFEB+ox-LDL组；组⑥：TFEBK316R+ox-LDL组(2)取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于6孔培养板中，在含160nMPMA62 上海交通大学2012级博士学位论文的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；(3)吸弃培养基，PBS漂洗2次，加入含有ox-LDL（终浓度为50μg/mL）和3H-胆固醇（终浓度为5μCi/mL）的1640培养基，置于细胞培养箱中孵育24h；(4)吸弃培养基，PBS漂洗2次，加入含有0.2%(w/v)BSA的1640培养基，平衡过夜；(5)吸弃培养基，PBS漂洗2次，加入含有50µg/mLapoA-I或HDL的1640培养基中孵育24h，置于细胞培养箱中孵育16h，诱导胆固醇的流出；(6)收集上清培养基，4°C13000g离心10min，去除细胞碎片，液体闪烁仪测定上清液的放射性活性。(7)PBS漂洗2次，加入500μL0.1MNaOH，使细胞膜破裂，液体闪烁仪测定细胞中的放射性活性。(8)计算胆固醇流出率：胆固醇流出率=培养液放射强度(cpm)/[培养液放射强度(cpm)+细胞裂解物放射强度(cpm)]×100%。2.2.9检测TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞形成的影响2.2.9.1实验分组：取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于10cm培养皿中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞后，对照组：组①~③各组巨噬细胞培养在正常的1640完全培养基中，ox-LDL组：组④~⑥各组巨噬细胞培养在含50μg/mLox-LDL的1640完全培养基中24h；实验分组：对照组：组①：NC组；组②：TFEB组；组③：TFEBK316R组ox-LDL组：组④：NC组+ox-LDL；组⑤：TFEB组+ox-LDL；组⑥：TFEBK316R组+ox-LDL2.2.9.2油红O染色观察泡沫细胞形成[85](1)固定：吸弃培养基，PBS漂洗2~3次，用4%多聚甲醛室温固定10~15min；63 上海交通大学2012级博士学位论文(2)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min，以清洗残余的多聚甲醛；(3)分化：加入新鲜配制的60%异丙醇分化5分钟；(4)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(5)配置油红工作液，油红储存液:ddH2O=3:2，滤纸过滤2~3次，除去杂质使染色结果更清晰；(6)染色：加入油红工作液，每孔加1.5~2ml，室温孵育30min；(7)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(8)再分化：加入60%异丙醇分化30s，至间质清晰，ddH2O漂洗2~3次；(9)显微镜观察，拍照。2.2.9.3Nilered染色观察泡沫细胞形成[86,53](1)细胞爬片：取生长状态良好的各组稳转细胞株接种于预先铺好无菌盖玻片的6孔培养板中，在含160nMPMA的1640完全培养基中培养72h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞；(2)诱导泡沫细胞：吸弃培养基，PBS漂洗1~2次，分别按照实验分组加入1640完全培养基或者含有ox-LDL（终浓度为50μg/mL）的1640完全培养基孵育24h；(3)固定：吸弃培养基，PBS漂洗1~2次，加入预冷的4%多聚甲醛固定10~15min；(4)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min，以清洗残余的多聚甲醛；(5)透化：加入0.5%TritonX-100处理10min，PBS漂洗2~3次，每次5min；(6)染色：配置Nilered工作液，Nilered储存液：ddH2O=1:1000，每孔加1.5~2ml，室温避光孵育10~15min；(7)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(8)染细胞核：配置DAPI工作液，DAPI储存液：ddH2O=1：1000；于切片上滴加DAPI工作液，100~150μL/片，室温避光染色约5min；(9)漂洗：PBS漂洗2~3次，每次5min；(10)封片：用抗荧光淬灭剂滴加到载玻片，用盖玻片封片；64 上海交通大学2012级博士学位论文(11)激光共聚焦显微镜下观察，拍照。每组细胞随机选取5个视野进行采图，并应用IPP6.0进行图像分析，并以平均脂变面积（视野内脂滴荧光总面积/视野内细胞数，单位：像素）评价细胞脂变程度。2.2.10统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计分析，所有计量数据均以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验，三组及三组以上采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。65 上海交通大学2012级博士学位论文3.结果3.1TFEB能够被SUMO-1修饰，第316位赖氨酸是TFEB的SUMO化修饰位点既往研究已证实TFEB能够发生SUMO化修饰，但是TFEB的SUMO化修饰位点仍不明确[87]。SUMO修饰位点的鉴定对于揭示SUMO化修饰蛋白的生理功能具有重要意义。研究表明，蛋白的SUMO化修饰发生在赖氨酸残基上，它的经典序列为ΨKXE，因此我们利用SUMOSP2.0软件对TFEB的SUMO化修饰位点做了预测，发现第316位的赖氨酸可能是SUMO-1连接的主要位点。随后，我们通过点突变的方法去验证Lys-316是否为TFEB的SUMO化修饰位点（图4）。如图5所示，只有在GFP-TFEB和FLAG-SUMO-1共表达的情况下，才能检测到发生了SUMO化修饰的TFEB条带。将Lys-316突变成精氨酸(TFEBK316R)后，TFEB的SUMO化修饰条带完全消失，说明TFEBK316R不能与SUMO-1结合。结果提示：第316位赖氨酸是TFEB的SUMO化修饰位点。图4第316位赖氨酸被精氨酸取代Fig.4Lys316isreplacedbyarginineresidues66 上海交通大学2012级博士学位论文图5Lys-316是TFEB发生SUMO化修饰的主要位点Fig.5Lys-316isthemajorSUMOylationsiteoftheTFEB3.2在巨噬泡沫细胞形成过程中，TFEB的SUMO化修饰水平的改变为了证明TFEB的SUMO化修饰是否参与了巨噬泡沫细胞形成过程，我们首先培养人THP-1单核细胞，诱导其分化成巨噬细胞，观察THP-1巨噬细胞内TFEB的SUMO化修饰水平。通过抗SUMO-1抗体沉淀的方法，我们在70kd左右观察到了内源性TFEB的SUMO化修饰条带（图6）。这一结果说明在巨噬细胞内TFEB能够与SUMO-1结合。随后，我们给予THP-1巨噬细胞50μg/mLox-LDL处理24h，诱导其发生泡沫化，发现TFEB的SUMO化修饰水平较未处理组明显降低，说明在ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中，TFEB的SUMO化修饰受到显著抑制（图7）。这些结果提示，TFEB的SUMO化修饰与巨噬泡沫细胞的形成有关，可能参与了巨噬泡沫细胞的形成。67 上海交通大学2012级博士学位论文图6THP-1巨噬细胞TFEB的SUMO化修饰水平Fig.6TFEBisSUMOylatedinTHP-1macrophage图7ox-LDL抑制THP-1巨噬细胞TFEB的SUMO化修饰水平Fig.7ox-LDLdecreasethelevelsofTFEBSUMOylationinTHP-1macrophage68 上海交通大学2012级博士学位论文3.3构建稳定表达SUMO化位点突变的TFEB巨噬细胞系为了进一步研究TFEB的SUMO化在巨噬泡沫细胞形成过程中的作用及机制，我们利用THP-1单核细胞株分别构建了稳定表达Vector、GFP-TFEB(TFEB)、GFP-TFEBK316R(K316R)的细胞系。如图8所示，TFEB和TFEBK316R组巨噬细胞均可看见绿色荧光，而NC组巨噬细胞未见荧光；随后，应用Real-timePCR及Westernblot检测稳转巨噬细胞株TFEB基因mRNA及蛋白表达水平。结果发现：两组稳转细胞株TFEBmRNA表达量显著升高，与NC组相比，分别上调(123.1±2.35)%和(120.8±3.29)%，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图9。并且，两组巨噬细胞株TFEB蛋白表达改变与mRNA表达变化一致，较NC组相比均显著升高。见图10。这些结果提示，稳定表达Vector、TFEB、TFEBK316R的THP-1巨噬细胞系构建成功。图8各组THP-1巨噬细胞GFP表达情况(×100)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组Fig.8ExpressionofGFPinTHP-1stablecells(×100)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage69 上海交通大学2012级博士学位论文图9qRT-PCR检测各组巨噬细胞TFEBmRNA表达情况NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与NC组相比Fig.9qRT-PCRanalysisofTFEBmRNAexpressioninTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththeNCgroup图10Westernblot检测各组巨噬细胞TFEB蛋白表达情况NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组Fig.10WesternblotanalysisofTFEBproteinexpressioninTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage70 上海交通大学2012级博士学位论文3.4TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬的影响既往研究表明TFEB是调控溶酶体生成及自噬过程最重要的转录因子[59-61]，因此，我们首先观察TFEB的SUMO化修饰对于自噬的影响。透射电镜下超微结构的形态学观察为检测自噬体的金标准。如图11所示，过表达TFEB明显诱导巨噬细胞自噬过程，自噬体数量较NC组显著增多，而TFEBK316组巨噬细胞自噬体数量较TFEB组明显减少(P<0.05)，自噬过程明显抑制。LC3是自噬生成最重要的指标，我们进一步分别采用westernblot和免疫荧光方法观察各组巨噬细胞LC3的蛋白表达情况。Westernblot结果显示：TFEB组巨噬细胞内LC3的蛋白表达量明显增加，LC3II/LC3I的比例升高(均P<0.05)；而TFEBK316R组巨噬细胞内LC3的蛋白表达量与NC组无明显差异。见图12。重要的是，免疫荧光方法检测结果与westernblot结果相一致，TFEBK316R组巨噬细胞内LC3抗体标记的自噬体较TFEB组细胞明显减少。见图13。这些结果说明，TFEB能够促进自噬体的生成，而TFEB的SUMO化修饰位点突变后，自噬体的生成受到显著抑制。提示：TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞的自噬过程。图11电镜观察各组巨噬细胞自噬体生成情况(×20000)71 上海交通大学2012级博士学位论文NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05，与TFEB组相比Fig.11ElectronmicroscopyanalysisofautophagosomesinTHP-1stablecells(×20000)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththeNCgroup,#P<0.05comparedwiththeTFEBgroup图12Westernblot检测各组巨噬细胞LC3表达情况NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组72 上海交通大学2012级博士学位论文*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05，与TFEB组相比Fig.12WesternblotanalysisofLC3expressioninTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththeNCgroup,#P<0.05comparedwiththeTFEBgroup图13免疫荧光观察各组巨噬细胞稳转株LC3表达情况(×400)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组Fig.13ImmunofluorescenceanalysisofLC3expressioninTHP-1stablecells(×400)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage3.5TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞溶酶体生成的影响下一步，我们观察TFEB的SUMO化修饰对于巨噬细胞溶酶体生成的影响。电镜结果显示：与NC组相比，过表达TFEB组巨噬细胞溶酶体数量增多、体积增大(P<0.05)，而TFEBK316R组巨噬细胞内溶酶体数量较NC组无明显差异。见图14。73 上海交通大学2012级博士学位论文LysoTrackerRed是一种溶酶体红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色，尤其是它可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。随后，我们采用LysotrackerRed染色观察各组巨噬细胞溶酶体的情况，结果发现：与NC组相比，过表达TFEB组巨噬细胞内红色荧光显著密度增加，溶酶体数量明显增多；而TFEBK316R组巨噬细胞内红色荧光密度较TFEB组巨噬细胞明显减弱，溶酶体数量显著减少(均P<0.05)。见图15。这些形态学结果表明，TFEB不仅可以促进溶酶体数量的增加，还可以增大溶酶体的体积；而TFEB的SUMO化修饰位点突变后明显抑制了TFEB诱导的溶酶体的改变。LAMP1是溶酶体生成最重要的指标，我们进一步分别采用westernblot和免疫荧光方法观察各组巨噬细胞LAMP1的蛋白表达情况。Westernblot结果显示：TFEB组巨噬细胞内LAMP1的蛋白表达量明显增加，较NC组上调3.5倍；而TFEBK316R组巨噬细胞内LAMP1的蛋白表达量与NC组无明显差异。见图16。重要的是，免疫荧光方法检测结果与westernblot结果相一致，如图17所示，TFEBK316R组巨噬细胞内LAMP1的蛋白表达量较TFEB组细胞明显下降(P<0.05)。这些结果说明，TFEB能够促进溶酶体的生成，而TFEB的SUMO化修饰位点突变后，溶酶体的生成受到显著抑制。提示：TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞溶酶体的生成。74 上海交通大学2012级博士学位论文图14电镜观察各组巨噬细胞溶酶体生成情况(×20000)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05，与TFEB组相比Fig.14ElectronmicroscopyanalysisoflysosomebiogenesisinTHP-1stablecells(×20000)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththeNCgroup,#P<0.05comparedwiththeTFEBgroup图15LysoTrackerred染色观察各组巨噬细胞溶酶体生成情况(×400)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组Fig.15LivecellimagingofmacrophagesstainedwithLysoTrackerred(×400)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage75 上海交通大学2012级博士学位论文图16Westernblot检测各组巨噬细胞LAMP1蛋白表达情况NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05，与TFEB组相比Fig.16WesternblotanalysisofLAMP1proteinexpressioninTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththeNCgroup,#P<0.05comparedwiththeTFEBgroup76 上海交通大学2012级博士学位论文图17免疫荧光观察各组巨噬细胞稳转株LAMP1表达情况(×400)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组Fig.17ImmunofluorescenceanalysisofLAMP1expressioninTHP-1stablecells(×400)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage3.6TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬溶酶体生成相关基因表达的影响TFEB是调控细胞自噬和溶酶体生成的最重要的转录因子[60,61]。已有研究报道SUMO化修饰能够调节多种转录因子的转录活性，那么SUMO化修饰TFEB对其转录活性是否有影响呢？为了回答这一问题，我们观察TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬及溶酶体生成相关基因表达影响。我们发现过表达TFEB不仅能够显著增加巨噬细胞自噬相关基因(LC3、ULK1、ATG9B、Becline1；图18)的表达水平，还能明显上调溶酶体生成相关基因(LAMP1、ATP6V1A、CTSB、CLCN7；图19)的表达，但是，TFEBK316R组内自噬溶酶体生成相关基因的表达量较TFEB组明显降低(均77 上海交通大学2012级博士学位论文P<0.05)。这些结果说明TFEB的SUMO化位点突变明显抑制了其下游自噬溶酶体生成及相关基因的表达。提示，TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞自噬溶酶体生成及相关基因的表达。图18qRT-PCR检测各组巨噬细胞自噬基因表达情况NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05，与TFEB组相比Fig.18qRT-PCRanalysisofautophagygenesexpressioninTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththeNCgroup,#P<0.05comparedwiththeTFEBgroup78 上海交通大学2012级博士学位论文图19qRT-PCR检测各组巨噬细胞溶酶体生成基因表达情况NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与NC组相比；#P<0.05，与TFEB组相比Fig.19qRT-PCRanalysisoflysosomebiogenesisgenesexpressioninTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththeNCgroup,#P<0.05comparedwiththeTFEBgroup3.7SUMO化修饰TFEB不影响其在细胞内的定位已有的研究表明，SUMO修饰能够改变靶蛋白的细胞定位，从而影响其功能，因此，TFEB被SUMO-1修饰后是否影响其定位成为我们关注的问题[75,76]。随后，我79 上海交通大学2012级博士学位论文们培养HeLa细胞，分别转染GFP-TFEB与GFP-TFEBK316R后，给予饥饿（Hank's平衡盐溶液）处理3h，荧光显微镜观察TFEB在细胞中的表达定位。如图20显示，正常条件下，GFP-TFEB与GFP-TFEBK316R均弥散分布于细胞核和细胞质，在给予饥饿处理后，GFP-TFEB与GFP-TFEBK316R均聚集到细胞核，并且，核质分离实验也证实了这一结果。见图21。说明SUMO修饰位点的突变并未影响TFEB在细胞内的定位改变。图20SUMO化位点突变TFEB的亚细胞定位(×400)TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组NC：正常培养基；Strave：Hank's平衡盐溶液Fig.20SubcellulardistributionofSUMOsitemutant-TFEB(×400)TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage;NC:normalmedia;Strave:Hank'sBalancedSaltSolution80 上海交通大学2012级博士学位论文图21SUMO化位点突变TFEB的亚细胞定位TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组N：NC,正常培养基；S：Strave,Hank's平衡盐溶液Fig.21SubcellulardistributionofSUMOsitemutant-TFEBTFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage;N:NC,normalmedia;S:Strave,Hank’sBalancedSaltSolution3.8TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞胆固醇流出的影响已有研究报道，自噬与巨噬细胞脂质代谢密切相关，它可以促进巨噬泡沫细胞内胆固醇酯的水解，促进游离胆固醇的流出，从而减少细胞内胆固醇酯的聚集[53]。我们之前的研究已证实SUMO化修饰TFEB通过调控其下游自噬溶酶体相关基因的表达，促进溶酶体生成和自噬过程。因此，我们推测SUMO化修饰TFEB可以增加巨噬泡沫细胞胆固醇酯水解程度，促进胆固醇流出，减少脂质在巨噬细胞的聚集。在给予各组巨噬细胞50μg/mLox-LDL刺激24h后，我们发现：TFEB组巨噬细胞内TC和CE含量较NC组明显降低，分别较NC组下降31%和60%(均P<0.05)；而TFEB81 上海交通大学2012级博士学位论文K316R组巨噬细胞内TC和CE含量较TFEB组巨噬细胞明显增加，分别上调21%和23%(均P<0.05)。见图22和23。并且，TFEB组巨噬细胞内胆固醇酯水解程度较TFEBK316R组显著增加(P<0.05)。见图24。进一步，我们分别以apoA-I和HDL作为胆固醇流出受体，检测SUMO化修饰TFEB对胆固醇流出的影响。如图25所示，与NC组相比，过表达TFEB明显增加apoA-I介导的胆固醇流出，而过表达TFEBK316R明显抑制了TFEB诱导的胆固醇流出(均P<0.05)。我们还观察到，TFEB的SUMO化位点突变未对HDL介导的胆固醇流产生影响。见图26。结果提示，TFEB的SUMO化促进巨噬细胞内胆固醇酯的水解，增加apoA-I介导的胆固醇的流出，减少细胞胆固醇酯的聚集。图22各组巨噬细胞总胆固醇含量NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与各自对照组相比；#P<0.05按照图例指示两组比较Fig.22ThecontentoftotalcholesterolinTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththerespectivenormalcontrolgroup,#P<0.05asindicated82 上海交通大学2012级博士学位论文图23各组巨噬细胞胆固醇酯含量NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与各自对照组相比；#P<0.05按照图例指示两组比较Fig.23ThecontentofcholesterolestersinTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththerespectivenormalcontrolgroup,#P<0.05asindicated83 上海交通大学2012级博士学位论文图24各组巨噬细胞胆固醇酯水解率NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与各自对照组相比；#P<0.05按照图例指示两组比较Fig.24ThecholesterolestershydrolysisinTHP-1stablecellsNC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththerespectivenormalcontrolgroup,#P<0.05asindicated84 上海交通大学2012级博士学位论文图25液体闪烁计数法检测各组巨噬细胞胆固醇流出(apoA-I)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与各自对照组相比；#P<0.05按照图例指示两组比较Fig.25CholesteroleffluxtoapoA-IwasmeasuredbyLiquidscintillationcounting.NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththerespectivenormalcontrolgroup,#P<0.05asindicated85 上海交通大学2012级博士学位论文图26液体闪烁计数法检测各组巨噬细胞胆固醇流出(HDL)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组Fig.26CholesteroleffluxtoHDLwasmeasuredbyLiquidscintillationcounting.NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage3.9TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞形成的影响为了观察TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞形成的影响，在给予各组细胞50μg/mLox-LDL刺激24h后，我们采用油红O及Nilered染色观察各组巨噬细胞株泡沫细胞形成。结果表明：TFEB组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成较NC组明显减少；而TFEBK316R组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成较TFEB组显著增多，说明TFEB的SUMO位点突变促进巨噬泡沫细胞形成。见图27和图28。结果提示，TFEB的SUMO化修饰通过促进溶酶体及自噬相关基因的表达，增加了溶酶体的生成及自噬过程，促进胆固醇的流出，最终减少了巨噬泡沫细胞的形成。86 上海交通大学2012级博士学位论文图27油红O染色观察各组巨噬细胞脂质聚集情况(×400)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与各自对照组相比；#P<0.05按照图例指示两组比较Fig.27LipiddropletswerevisualizedbyOilRedOstaining(×400)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththerespectivenormalcontrolgroup,#P<0.05asindicated87 上海交通大学2012级博士学位论文图28Nilered染色观察各组巨噬细胞脂质聚集情况(×400)NC：阴性对照组；TFEB：过表达TFEB组；K316R：过表达TFEBK316R组*P<0.05，与各自对照组相比；#P<0.05按照图例指示两组比较Fig.28LipiddropletswerevisualizedbyNileredstaining(×400)NC:negativecontrol;TFEB:overexpressionofTFEBinmacrophage;K316R:overexpressionofTFEBK316Rinmacrophage*P<0.05comparedwiththerespectivenormalcontrolgroup,#P<0.05asindicated88 上海交通大学2012级博士学位论文4.讨论本研究的主要发现是：首次证实了TFEB的SUMO化修饰通过调控自噬溶酶体的生成参与巨噬泡沫细胞的形成。有以下证据：1.在ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中，TFEB的SUMO化修饰水平明显降低，初步明确TFEB的SUMO化修饰与巨噬泡沫细胞形成的关系。2.TFEB的SUMO化修饰可以调控其下游溶酶体和自噬生相关基因的表达，从而影响溶酶体的生成和自噬过程。3.TFEB的SUMO化修饰能够促进巨噬细胞胆固醇酯水解，进一步增加胆固醇的流出。4.TFEB的SUMO化修饰能够明显抑制巨噬泡沫细胞的形成。AS是一个多病因的复杂病理过程，从早期的脂质条纹形成到最终粥样硬化斑块，巨噬泡沫细胞均起到了关键性的作用[16,88,89]。研究表明，巨噬泡沫细胞的形成与细胞胆固醇代谢密切相关[24,90]。正常情况下，修饰性低密度脂蛋白被巨噬细胞清道夫受体摄取后被中性胆固醇水解酶分解为游离胆固醇，通过细胞膜上的转运体ABCA1和ABCG1介导从细胞流出，从而维持巨噬细胞内胆固醇的稳态，最终减少脂质在巨噬细胞的聚集和泡沫细胞的形成。当细胞内脂质摄入超过胆固醇的流出，就会导致细胞内大量脂质蓄积，而最终形成巨噬泡沫细胞。在这一过程中，胆固醇流出被认为是减少巨噬泡沫细胞形成的关键环节。而巨噬细胞脂质的水解作为胆固醇流出的上游，也是胆固醇流出的限速步骤[91,92]。因此，调控巨噬细胞脂质的水解，促进胆固醇流出对于阻止泡沫细胞的形成及缓解AS的发生、发展具有重要意义。近年来，自噬已成为生物学领域的一个研究热点，其在AS中的重要作用受到广泛关注[56,93-95]。研究发现，在人动脉粥样硬化斑块中存在自噬样特性，如髓鞘样结构、细胞质中泛素化包涵体聚集以及空泡形成增多[69,96]。并且，Razani等证实了自噬可以抑制AS斑块进展，在ApoE-/-小鼠沉默ATG5和Becline1后，小鼠动脉粥样硬化程度加重，并且斑块中的炎症因子明显增加[57]。巨噬细胞是动脉粥样硬化损伤过程中的炎性细胞，同时也是动脉粥样硬化斑块中形成泡沫细胞的主要成分。大量研究证实，抑制巨噬细胞自噬过程明显抑制细胞内胆固醇酯的水解，减少胆固醇的流出，89 上海交通大学2012级博士学位论文增加泡沫细胞的形成[53,97,98]。因此，自噬过程在AS巨噬泡沫细胞形成过程中发挥着关键性的作用，进一步发现调控自噬相关信号途径的关键分子，促进巨噬细胞内胆固醇酯的水解及胆固醇的流出，减少巨噬泡沫细胞形成，将为AS的防治提供新的治疗策略及治疗靶点。近年来，对自噬调节机制的研究取得了一定的进展。雷帕霉素激酶能够抑制自噬的发生，对调节细胞生长具有重要的作用。Atg1(在酵母中命名为Atgl，在哺乳动物同源蛋白命名为ULKl)复合物是白噬体形成过程中的一个重要的正调控因子。当细胞营养充足时，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORCI)与Atgl/ULKl复合物结合抑制自噬。当细胞处于饥饿的条件下，mTORCI与Atgl/ULKl分离，从而诱导自噬体的成核和延伸。并且，多种转录因子如P53，FOXO，TFEB等均被证实可以调控自噬[60,99-102]。在这些转录因子中，TFEB是调控溶酶体生成及自噬过程最重要的转录因子。我们前期研究发现，AS模型LDLR-/-小鼠腹腔巨噬细胞TFEB的表达水平较对照小鼠明显下降；随后，我们采用不同浓度ox-LDL刺激小鼠巨噬细胞株Raw264.7发生泡沫化，观察到TFEB的表达呈现浓度依赖性降低。基于这些研究，我们初步推测TFEB在巨噬泡沫细胞形成中起到重要作用。为了证实这一推测，随后，我们研究发现过表达TFEB能够调控溶酶体的生成及自噬过程，促进胆固醇的流出，从而减少巨噬泡沫细胞的形成。这一结果与Emanuel等[98]的报道相一致，TFEB通过诱导自噬溶酶体的生成，促进巨噬细胞胆固醇流出，减少脂质的聚集。因此，我们得出结论：在高脂环境下，TFEB表达明显减少，自噬过程受阻，胆固醇流出降低导致大量脂质堆积在巨噬细胞中加速了巨噬泡沫细胞的形成及斑块的进展。但是，TFEB如何调控自噬过程进而影响巨噬泡沫细胞的形成，目前仍不清楚。因此，进一步认识TFEB自身表达变化的调控机制为研究AS的发病机制提供了一个新的视角，并为我们探索其如何在巨噬泡沫细胞形成过程中发挥作用提供重要的理论依据。蛋白质翻译后修饰对于蛋白质的成熟、稳定以及蛋白质功能的行使具有重要作用。细胞内存在多种翻译后修饰形式，如磷酸化(phosphorylation)、乙酰化(acetylation)、泛素化(ubiquitination)、甲基化(methylation)以及SUMO化(SUMOylation)等，本质90 上海交通大学2012级博士学位论文上它们都是将一些小分子蛋白或者分子基团结合到底物蛋白上的共价修饰方式。但是，不同的翻译后修饰形式所需要的酶的种类以及酶催化底物的过程不同，这就决定了它们对底物调控以及自身调控的差异性。SUMO化修饰是一种细胞内广泛存在且具有重要功能的蛋白质翻译后修饰，通过活化酶(E1)、结合酶(E2)和连接酶(E3)的酶促级联反应将SUMO小分子共价结合在靶蛋白的赖氨酸残基上，通过使蛋白质的活性、细胞内的定位和蛋白质相互作用发生改变，从而影响蛋白质的降解及功能[75,76]。已有研究表明TFEB能够发生SUMO化修饰[87]。我们前期研究进一步证实TFEB能够与SUMO-1结合，并且Lys-316是TFEB发生SUMO化修饰的位点，因此，我们推测TFEB的SUMO化修饰能够调控溶酶体生成与自噬过程，进一步影响巨噬细胞内胆固醇酯的水解及胆固醇的流出，参与巨噬泡沫细胞的形成。为了证实这一结论，我们首先确定在巨噬泡沫细胞形成过程中，TFEB的SUMO化修饰水平的改变；其次，详细分析TFEB的SUMO化修饰对溶酶体生成及自噬过程的影响；进一步观察TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞脂质水解及胆固醇流出的影响；最后证实TFEB的SUMO化修饰对巨噬泡沫细胞形成的影响。为了证实TFEB的SUMO化修饰是否参与了巨噬泡沫细胞形成，我们首先观察巨噬细胞内TFEB的SUMO化修饰水平。本研究以PMA诱导的THP-1巨噬细胞为研究对象，通过抗SUMO-1抗体沉淀的方法，在THP-1巨噬细胞中检测到了内源性的TFEB的SUMO化修饰条带。这一实验结果与之前的研究结果相一致[87]，说明巨噬细胞内TFEB能够发生SUMO化修饰。ox-LDL通过促进脂质蓄积、炎症反应等多种途径促进动脉粥样硬化的发生发展，是致动脉粥样硬化的独立危险因素[103,104]。因此，本研究通过ox-LDL诱导THP-1巨噬细胞发生泡沫化，构建巨噬泡沫细胞模型。我们前期研究采用不同浓度(10,25,50,100μg/mL)ox-LDL刺激THP-1巨噬细胞24h，通过油红O染色观察巨噬泡沫细胞形成情况，发现用50μg/mLox-LDL刺激THP-1巨噬细胞24h时，巨噬泡沫细胞形成最多。随后，我们采用50μg/mLox-LDL刺激THP-1巨噬细胞24h，观察THP-1巨噬细胞内TFEB的SUMO化修饰水平的改变。结果显示，ox-LDL显著抑制了巨噬细胞TFEB的SUMO化修饰91 上海交通大学2012级博士学位论文水平。因此，通过观察TFEB的SUMO化在泡沫细胞形成过程中变化的研究，我们初步证实TFEB的SUMO化修饰与巨噬泡沫细胞的形成有关，可能参与了巨噬泡沫细胞的形成。为了阐明TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞中的关键作用，我们利用THP-1单核细胞株分别构建了稳定表达TFEB、SUMO位点突变的TFEB(TFEBK316R)的细胞系，比较分析TFEB和TFEBK316R巨噬细胞中溶酶体及自噬生成情况，明确TFEB的SUMO化修饰对溶酶体及自噬生成的影响。我们发现过表达TFEB能够促进溶酶体的生成及自噬过程，而TFEB的SUMO化修饰位点突变后，溶酶体的生成及自噬过程受到显著抑制。说明TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞溶酶体的生成及自噬过程。已有研究表明，TFEB通过与溶酶体及自噬相关基因启动子区CLEAR元件结合，调控溶酶体与自噬相关基因的表达，参与调节溶酶体生成及自噬过程[59-61]。SUMO化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程，它在活化酶(E1)、结合酶(E2)和连接酶(E3)的依次作用下共价结合在靶蛋白的赖氨酸残基上，通过使蛋白质的活性、细胞内的定位和蛋白质相互作用发生改变，从而影响蛋白质的降解及功能[75,76]。为了进一步研究TFEB的SUMO化修饰对溶酶体及自噬生成的机制，我们首先观察TFEB的SUMO化修饰位点的突变是否影响其转录活性及下游自噬溶酶体相关基因的表达，明确TFEB的SUMO化修饰对其下游基因表达的影响。我们的研究结果发现，TFEB的SUMO化位点突变明显抑制了其下游自噬溶酶体生成及相关基因的表达。提示，TFEB的SUMO化修饰促进巨噬细胞自噬溶酶体生成及相关基因的表达。随后，我们培养HeLa细胞，分别转染GFP-TFEB与GFP-TFEBK316R，观察到在正常培养基和饥饿条件下，SUMO修饰位点的突变并未影响TFEB的定位改变。这些结果表明，TFEB的SUMO化修饰通过诱导其下游自噬溶酶体生成及相关基因表达，促进巨噬细胞溶酶体的生成及自噬过程。已有研究报道，自噬与巨噬细胞脂质代谢密切相关，它可以促进巨噬泡沫细胞内胆固醇酯的水解，促进游离胆固醇的流出，从而减少细胞内胆固醇酯的聚集[53]。随后，我们观察TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞脂质代谢及胆固醇流出的影响。在92 上海交通大学2012级博士学位论文给予TFEB和TFEBK316R巨噬细胞ox-LDL处理24h后，我们发现：与NC组相比，TFEB组巨噬细胞内TC和CE含量明显降低，胆固醇酯水解程度显著增加，apoA-I介导的胆固醇的流出增多；而TFEBK316R组巨噬细胞内TC和CE含量明显增加，胆固醇酯水解程度显著降低，apoA-I介导的胆固醇流出减少。这些结果进一步表明，TFEB的SUMO化促进巨噬细胞内胆固醇酯的水解，增加胆固醇的流出，减少细胞胆固醇酯的聚集。在本研究中，我们发现TFEB主要促进了巨噬细胞apoA-I介导的胆固醇的流出，但是未影响HDL介导的胆固醇的流出。这一结果与之前研究结果一致，证实了自噬主要是通过促进巨噬细胞apoA-I介导的胆固醇流出抑制细胞脂质的聚集[53]。并且，我们进一步发现TFEB的SUMO化修饰位点突变后，巨噬细胞apoA-I介导的胆固醇流出明显减少，但是，HDL介导的胆固醇流出没有变化。这一结果说明TFEB的SUMO化修饰促进了巨噬细胞apoA-I介导的胆固醇流出。最后，我们采用油红O染色和Nilered染色方法进一步分析比较巨噬泡沫细胞形成情况。结果表明：TFEB组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成较NC组明显减少；而TFEBK316R组巨噬细胞内脂滴聚集及泡沫细胞形成较TFEB组显著增多，说明TFEB的SUMO位点突变促进巨噬泡沫细胞形成。综上所述，我们的研究证实TFEB的SUMO化修饰通过促进巨噬细胞溶酶体及自噬相关基因的表达，增加了溶酶体的生成及自噬过程，促进apoA-I介导的胆固醇的流出，最终减少了巨噬泡沫细胞的形成。见图29。本研究首次围绕TFEB的SUMO化修饰对巨噬细胞自噬溶酶体形成的调控作用及机制的研究，证实了其在巨噬泡沫细胞形成中的作用。尤其是将SUMO化修饰与自噬作用相联系，探讨巨噬泡沫细胞形成的机制，为AS研究提供新的研究靶点，也为动脉粥样硬化性心血管疾病的防治提供新的思路。但是，体内研究TFEB的SUMO化修饰能否通过促进RCT过程，减少巨噬泡沫细胞的形成，缓解AS的发生、发展过程尚需我们继续研究探讨。这将是我们今后要进一步开展的工作。93 上海交通大学2012级博士学位论文5.结论本研究的结论可简单概括为以下三点：一、ox-LDL诱导巨噬细胞泡沫化过程中，TFEB的SUMO化修饰水平明显降低，初步明确TFEBSUMO化修饰与巨噬泡沫细胞形成的关系。二、TFEB的SUMO化修饰可以调控其转录活性，影响其下游溶酶体生成和自噬形成相关基因的表达，从而促进巨噬细胞溶酶体的生成和自噬过程。三、TFEB的SUMO化修饰通过促进巨噬细胞胆固醇酯水解，增加胆固醇的流出，最终减少泡沫细胞的形成。图29TFEB的SUMO化修饰在巨噬泡沫细胞形成中的机制Fig.29SchematicdrawingdemonstratingapreviouslyuncharacterizedmechanismforregulatingmacrophagefoamcellformationbySUMOylationofTFEB.SU,SUMO-1.94 上海交通大学2012级博士学位论文参考文献[1]LusisAJ:Atherosclerosis.Nature2000,407(6801):233-241.[2]GalkinaE,LeyK:Immuneandinflammatorymechanismsofatherosclerosis(*).Annualreviewofimmunology2009,27:165-197.[3]MozaffarianD,BenjaminEJ,GoASetal:Heartdiseaseandstrokestatistics--2015update:areportfromtheAmericanHeartAssociation.Circulation2015,131(4):e29-322.[4]GlassCK,WitztumJL:Atherosclerosis.theroadahead.Cell2001,104(4):503-516.[5]Rafieian-KopaeiM,SetorkiM,DoudiMetal:Atherosclerosis:process,indicators,riskfactorsandnewhopes.Internationaljournalofpreventivemedicine2014,5(8):927-946.[6]EsperRJ:[Fromriskfactorsofarterialdiseasetoatheromaplaquedetectionofthehigh-riskplaque].RevistadelaFacultaddeCienciasMedicas2004,61Suppl1:39-52.[7]LibbyP,RidkerPM,HanssonGK:Progressandchallengesintranslatingthebiologyofatherosclerosis.Nature2011,473(7347):317-325.[8]RossR:Atherosclerosis--aninflammatorydisease.TheNewEnglandjournalofmedicine1999,340(2):115-126.[9]HanssonGK:Inflammation,atherosclerosis,andcoronaryarterydisease.TheNewEnglandjournalofmedicine2005,352(16):1685-1695.[10]EgashiraK:Clinicalimportanceofendothelialfunctioninarteriosclerosisandischemicheartdisease.Circulationjournal:officialjournaloftheJapaneseCirculationSociety2002,66(6):529-533.[11]DavignonJ,GanzP:Roleofendothelialdysfunctioninatherosclerosis.Circulation2004,109(23Suppl1):III27-32.95 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上海交通大学2012级博士学位论文攻读学位期间发表的论著1.QiPang,JieXiong,Xiao-LeiHuetal:UFM1ProtectsMacrophagesfromoxLDL-inducedfoamcellformationthroughaliverXreceptorαdependentpathway.JournalofAtherosclerosisandThrombosis.(Accept)2.QiPang,Jiang-PingHe,Guang-YaZhangetal:SUMOylationofTFEBsuppressesmacrophagefoamcellformationbypromotingautophagy-lysosomebiogenesis.(Submitted)105 上海交通大学2012级博士学位论文致谢本课题是在我的导师陈凤玲教授和程金科研究员的精心指导下完成的。衷心感谢尊敬的导师陈凤玲教授三年来在学习、科研、生活等诸多方面给予我无微不至的关怀和悉心指导，我的每一点进步、每一点成绩都凝结着导师的辛勤汗水和无微不至的关怀。陈老师渊博的临床知识、认真细致的工作作风、无私奉献的敬业风范以及热情耐心的高尚医德，将使我受益终身！传道授业解惑之恩，感激不尽！师生情深，永生难忘！衷心感谢尊敬的科研导师程金科研究员在实验期间提供的课题支持和无私的教导与鼓励！程老师渊博的科研知识、严谨的科研态度、学以致用的科研思路、勇于创新的科研精神、勤奋踏实、雷厉风行的工作态度，平易近人的大家风范使我受益匪浅，对我影响至深，是我学习的榜样，激励着我在以后的人生道路上不断拼搏！衷心感谢感谢程金科实验室的左勇老师和蔡蓉老师，特别是在我实验期间给予的无私支持和帮助，让我开阔了眼界，增加了技能。本论文的完成还离不开实验室同学的支持和帮助，他们友情、关怀和指点直接为我的实验铺平了道路，在此特向程金科实验室的兄弟姐妹们：王田石、屠俊、陈亚兰、魏波、夏南松、蔡娟、刘炳婷、肖宁、黄弦、郑铨、曹颖、田晶、李艳、王秀芝等表示真挚的谢意。衷心感谢我的师弟、师妹们：熊杰、何茳萍、张光亚、李园园、张丹丹等，怀念与你们在一起的时光，正是有了你们，在科研的道路上我从未感觉孤单。衷心感谢父母长期以来给予的关怀和支持！正是您们默默给予我的支持以及在我处于低谷时对我真诚的鼓励，才让我有了勇往直前的那份勇气。衷心感谢所有关心过我、帮助过我和支持过我的师长、同学和朋友们！106