n2a细胞氧糖剥夺模型中ⅲ型pi3k-beclin 1自噬途径的研究

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1、上海交通大学硕士学位论文N2a细胞氧糖剥夺模型中Ⅲ型PI3K-Beclin1自噬途径的研究学科专业：神经病学硕士研究生：谌雯琦学号：1127259542导师：孙晓江教授指导教师：刘康永老师研究方向：脑血管病的实验研究申请学位：硕士答辩日期：2015年5月培养单位：上海交通大学附属第六人民医院资助基金：国家自然科学基金（批准号：31371065）IDissertationSubmittedtoShanghaiJiaoTongUniversityfortheDegreeofMasterTHERESEARCHOFCLASSⅢPI3K-BECLIN

2、1AUTOPHAGICPATHWAYSINOXYGENANDGLUCOSEDEPRIVATIONMODELOFN2ACELLSSpeciality:NeurologyCandidate:WenqiChenStudentID:1127259542Supervisor:Prof.XiaojiangSunAdvisor:KangyongLiuResearchdirection:ExperimentalstudyofcerebralvasculardiseasesAcademicDegree:MasterDateofDefence:May,2015

3、Cultivationunits:TheSixthPeople'sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaoTongUniversityGrant:TheProjectofNationalNaturalScienceFoundationofChina(No:31371065)II上海交通大学硕士研究生学位论文（2015）N2a细胞氧糖剥夺模型中Ⅲ型PI3K-Beclin1自噬途径的研究摘要我国作为人口大国，早已步入了老龄化社会。年龄作为脑血管疾病的不可干预危险因素，卒中患病率随年龄逐渐上升，60岁～64岁达到患病高峰，

4、随后逐渐下降。2014年中国脑卒中大会的数据表明，近25年，我国脑卒中患病率以每年8.1%速度增加。脑梗死在我国卒中患者数量中位居首位，约占78%。缺血性脑卒中的发生发展机制复杂，尚未完全明确。因此，近年来，探索缺血性脑卒中的发生发展机制已成为神经科学领域研究的重点和难点。自噬是一种由溶酶体介导的细胞内代谢机制。该机制负责降解和循环再利用受损及功能丧失的细胞成分和细胞器。自噬过程主要包括自噬体的形成以及自噬溶酶体的形成（后者是自噬体与溶酶体的融合）。近年来，越来越多的研究表明自噬参与脑血管疾病之中。但至于自噬在脑血管疾病发生发展中的作用，目

5、前并没有统一的定论。脑缺血可以通过多种信号通路来激活自噬，本实验主要探讨Ⅲ型PI3K-Beclin1自噬途径在缺血性脑血管疾病中的作用。本实验首先采用小鼠神经瘤母细胞（mouseneuroblastomaN2acells，N2a）经过氧糖剥夺(oxygenandglucosedeprivation,OGD)处理来模拟脑缺血损伤。自噬相关蛋白包括微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lightchain3,LC3）、Beclin1、P62又称为死骨片1（Sequestosome1,SQSTM1）和溶

6、酶体相关膜蛋白2（lysosome-associatedmembraneprotein2,LAMP2)等。应用westernV上海交通大学硕士研究生学位论文（2015）blot方法检测这些自噬相关蛋白的表达量，并测定经过OGD处理后N2a细胞酸性磷酸酶活性及细胞活力。然后我们检测了PI3K抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA）对经过OGD处理的N2a细胞自噬相关蛋白表达水平，细胞活力及酸性磷酸酶活性的影响。最后我们应用shRNA慢病毒技术干扰Beclin1基因表达后再分析经过OGD处理的N2a细胞自噬相关蛋白表达、

7、酸性磷酸酶活性以及细胞活力的影响。结果显示：1）在OGD处理后，N2a细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及p62/SQSTM1蛋白均表达增加，而LAMP2蛋白变化不明显；OGD处理增加了酸性磷酸酶活性而减弱了细胞活力。2）N2a细胞给予3-MA（5mM）后，减少了经过OGD处理后LC3Ⅱ以及LC3Ⅱ/Ⅰ的表达，增加了p62/SQSTM1的表达，而对LAMP2和Beclin1的蛋白表达影响不明显；不管是对照组还是OGD组，使用3-MA后，N2a细胞酸性磷酸酶活性和细胞活力都明显下降。3）无论在对照组，还是在OGD8h和OGD12h组，

8、当Beclin1的表达被干扰后，N2a细胞LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62/SQSTM1和LAMP2蛋白表达均增加、酸性磷酸酶活性增加，而细胞活力变化不明显。综上所述，本研究通过以