bfgf单克隆抗体的制备及其对lewis’肺癌抑制作用的研究

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1、暨南大学硕士学位论文题名（中英对照）：bFGF单克隆抗体的制备及其对Lewis’肺癌抑制作用的研究ProductionofbFGFmonoclonalantibodyanditsinhibitionofLewis’lungcarcinoma作者姓名：罗镇明指导教师姓名及学位、职称：王宏博士副教授学科、专业名称：理学免疫学学位类型：学术学位论文提交日期：论文答辩日期：2015年6月1号答辩委员会主席：郑利民教授论文评阅人：石磊教授、熊静波教授学位授予单位和日期：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。除

2、了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:签字日期:《月V曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学

3、位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名:气签字日期：年6月7^曰签字日期：4学位论文作者毕业后去向:工作单位：电话:通讯地址:邮编:摘要目的：针对bFGF与FGFR1结合位点制备bFGF单克隆抗体，并初步研究其在体内和体外对Lewis’肺癌的抑制作用及机制。方法：以重组人bFGF皮下多点免疫BALb/c小鼠，取脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0常规融合，通过间接ELISA和竞争ELISA筛选出能稳定分泌靶向bFGF-FGFR1结合位点的单抗的细胞株；将细胞株注入小鼠腹腔，制备腹水型单抗，并通过ProteinG亲和柱进行纯化、S

4、DS-PAGE纯度鉴定；纯化的抗体经竞争ELISA测定其与FGFR1βⅢc的竞争效率、间接ELISA测定相对亲和常数；克隆目的细胞株bFGF抗体Fv区的基因，软件模拟Fv-bFGF结合位点并与bFGF-FGFR1结合位点相比较；利用CCK-8法检测抗体对Lewis’肺癌细胞的增殖抑制效果、transwell实验检测抗体对Lewis’肺癌细胞的迁移抑制效率；建立C57BL/6小鼠Lewis’肺癌的皮下移植瘤模型，瘤周注射bFGF单抗，测量瘤组织大小并观测肿瘤肺部转移情况；通过q-PCR和westernblot检测抗体作用后Lewis’肺癌细胞内E

5、-cadherin的表达量变化及胞内信号分子c-src和β-catenin磷酸化水平的变化情况。结果：筛选出了两株能稳定分泌bFGF抗体且能与FGFR1βⅢC竞争结合bFGF的细胞株MabE12和MabD9，竞争ELISA测得其IC50分别为1.564µg/mL和1.96µg/mL，选取竞争8效果较好的MabE12为研究对象，间接ELISA测得MabE12的亲和常数为5.66×10L/mol；DiscoveryStudio软件模拟抗体MabE12Fv区与bFGF的结合显示其结合位点与FGFR1-bFGF的结合位点存在很大的相似性；CCK-8实验

6、结果显示MabE12对Lewis’肺癌细胞有较好的抑制效果，IC50为41µg/mL；transwell结果表明MabE12对Lewis’肺癌细胞的迁移能力有抑制效果（p<0.05）；动物实验结果显示MabE12抗体治疗组与对照组瘤组织大小差异不显著（p=0.056）但瘤组织内E-cadherin的表达增加（p<0.05）；MabE12通过剂量依赖性方式促进E-cadherin的表达（p<0.05），提高c-src、β-catenin的磷酸化水平。结论：成功筛选到了两株能稳定分泌针对bFGF与FGFR1结合位点的单抗的细胞株，其中一株抗体Mab

7、E12在体外能抑制Lewis’肺癌细胞的迁移并提高Lewis’肺癌细胞中E-cadherin的表达量，这一过程主要是通过提高c-src和β-catenin的磷酸化的水平来实现的。关键词bFGF；单克隆抗体；肺癌；转移IAbstractObjective:Toproducemousemonoclonalantibody(McAb)againstbasicfibroblastgrowthfactor（bFGF）ofhumandirectlyatthebindingsiteofbFGFwithFGFR1andthenpreliminarilystud

8、yitsanti-tumoractivityandmechanismofLewis’lungcarcinoma.Methods:BALB/cmicew