鸡ifn-α-il-18酵母表达及其与中药单体联合抗ibdv作用的研究

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文鸡IFN-α-IL-18酵母表达及其与中药单体联合抗IBDV作用的研究ExpressionofchickenIFN-α-IL-18geneinP.Pastorisandantiviralactivitiesofthefusionproteinwithdifferentmedicinalplantmonomersagainstinfectiousbursaldiseasebirus学位申请人：杨惠指导教师：李银聚教授一级学科：生物学二级学科：生物化学与分子生物学学位类别：理学硕士2015年04月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导

2、师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：摘要摘要鸡传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种急性、高接触性传染病。近年来，由于超强毒株和变异株的出现，传统疫苗的免疫效果已不尽理想，病发后的治疗难度也随之增强，因此，新型抗IBDV制剂的研究已成为当前养禽业的关注热点。本研究将鸡的IFN-α和I

3、L-18基因融合后于毕赤酵母中表达，通过对表达产物的生物学活性检测和抗IBDV中药单体的筛选，研究重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白、中药单体以及二者联合抗IBDV效果和抗病毒机制，为研究抗IBDV新型制剂提供新的思路。1.重组鸡IFN-α-IL-18酵母表达载体的构建与表达为探讨鸡IFN-α和IL-18及其融合蛋白的结构和功能，本研究将鸡IFN-α、IL-18及其融合基因分别置于酵母表达载体pPICZ-αA的AOX1启动子下游，构建重组质粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IL-18和pPICZ-IFN-α-IL-18。将重组质粒分别用PmeI酶切线性化，电转入

4、X-33酵母感受态细胞中，以1%甲醇诱导表达，SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。结果表明，在酵母培养上清液中存在分子量分别为22KD、23KD和43KD的目的蛋白，且该蛋白具有良好的免疫原性。2.重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白的生物学活性研究为探讨鸡IFN-α-IL-18融合蛋白对鸡外周血淋巴细胞转化及核因子κB（NF-κB）的影响。本研究应用淋巴细胞转化试验初步检测重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白的生物学活性，ELISA法测定淋巴细胞中总NF-κB和细胞核中NF-κB的含量。结果表明，表达的IFN-α-IL-18和IL-18蛋白均能明显

5、促进鸡外周血淋巴细胞的转化（P<0.05），IFN-α对淋巴细胞转化有促进作用，但总体差异不显著（P>0.05）。与对照组相比，经IFN-α-IL-18和IL-18作用的鸡淋巴细胞中总NF-κB含量明显增加（P<0.05），细胞核中NF-κB含量差异极显著（P<0.01），IFN-α作用的淋巴细胞中总NF-κB含量与对照组相比差异不显著（P>0.05），细胞核中NF-κB含量显著增加（P<0.05）。IFN-α-IL-18及IL-18能够明显促进淋巴细胞转化，IFN-α促进淋巴细胞转化活性较弱，这种促淋转机制与NF-κB的表达、活化及核质转运有关。3.重组鸡IFN-α

6、-IL-18融合蛋白的抗IBDV效果研究及抗IBDV中药单体的筛选为进一步探讨重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白的抗IBDV活性并筛选出抗IBDV的中药单体，本研究通过鸡胚接种试验对IFN-α-IL-18及连翘苷元、黄芪苷、黄芩素、绿原酸、木犀草酸、马钱酸6种中药单体的抗IBDV效果进行评价。结果1摘要表明，IFN-α-IL-18融合蛋白能够显著抑制IBDV在鸡胚中的增殖（P<0.01），IFN-α和IL-18酵母表达产物对IBDV也有明显的抑制作用（P<0.05）。六种中药单体都能一定程度地发挥抗IBDV活性，其中，黄芩素和绿原酸作用极显著（P<0.01）。4.重

7、组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白与中药单体的联合抗IBDV效果研究为探索重组鸡IFN-α-IL-18融合蛋白与中药单体的联合抗IBDV效果，本研究将筛选出的具有明显抗IBDV的中药单体黄芩素和绿原酸，分别与不同浓度的重组鸡IFN-α-IL-18蛋白进行组合，接种9日龄鸡胚。IBDV抗原检测结果表明，联合使用黄芩素和重组蛋白IFN-α-IL-18对IBD的预防效果极显著（P<0.01），且优于中药单体组及重组蛋白组。攻毒保护试验中，黄芩素和重组鸡IFN-α-IL-18蛋白组发病率最低，且无病鸡死亡，起到了较好的保护作用。联合使用时，采用10μM黄芩及