rev感染spf鸡中il-6、il-18和ifn-γ的定量检测

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1、山东农业大学硕士学位论文REV感染SPF鸡中IL--6、IL--18和IFN--γ的定量检测姓名：陈雪锋申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：胡敬东20120615山东农业人学硕上学位论义中文摘要白细胞介素6又称B细胞刺激因子，是诱导B细胞产生抗体的必需因子之一，其分泌水平的高低可以反映机体的体液免疫功能。白细胞介素18又称为t干扰素诱生因子，是一种具有多向和多层次免疫调节功能的细胞因子。IFN吖是一种免疫调节的多效性因子，哺乳动物和禽IFN-7被用作感染机体细胞介导免疫的指示器。当前，免疫抑制病给我国集约化养鸡业带来了很大危害

2、，禽网状内皮组织增生症病毒感染后可导致体液和细胞介导免疫应答的严重抑制已有很多报道，了解免疫抑制机理并制定提高鸡的免疫应答策略正成为当前的研究热点。本研究以禽网状内皮组织增生症病毒人工接种SPF鸡造成的免疫抑制为模型，对ChlL．6、ChlL一18和ChlFNq在免疫抑制中可能发挥的作用进行了初步探讨。研究内容主要包括三部分：1．实时荧光定量RT-PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡主要免疫器官中IL．18基因表达量的研究。为了研究ChlL．18基因在禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡体内的表达水平，130只1日龄SPF鸡

3、随机分为2组，禽网状内皮组织增生症病毒处理组和生理盐水对照组。每个处理组分别在感染后7、14、21、28、35、42和49d随机取8只鸡处死，迅速取脾脏、胸腺和法氏囊样品用于RNA提取。应用本实验室已建立的SYBRGreenI染料实时荧光定量RT-PCR方法，比较处理组和对照组ChlL．18基因mRNA相对表达量的变化。结果显示，与对照组相比，处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL．18的分泌水平除感染后14d脾脏外，在感染后7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均显著升高(P

4、hlFN-1,的SYBRGreenI荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank上ChlL．6和ChlFN-),基因的序列，在保守区设计并合成各自特异引物，并以核糖体蛋白亚基4基因为内参，采用SYBRGreenI染料以建立实时荧光定量RT-PCR检测方法。将ChlL．6、ChlFN-1,与核糖体蛋白亚基4部分基因克隆至pMDl8．T载体上，以各阳性质粒作为标准品，构建标准曲线，并进行熔解曲线分析。结果表明，该方法对ChlL-6和ChlFN-1,mRNA的扩增效率均为107％左右，线性范围为lO。2～10～，相关系数为0．998以上，最

5、低REV感染SPF鸡中IL-6、IL-18和IFN-,／的定量检测能检出100拷贝／gL；从RNA提取到荧光定量PCR结束的检测周期只需4h。本研究所建立的ChlL．6和ChlFN吖基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短，为在转录水平对ChlL．6和ChlFN-2'的定量分析奠定了基础。3．实时荧光定量RT-PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡主要免疫器官中IL．6和IFN-2'基因表达量的研究。为了研究ChlL．6和ChlFN-丫基因在禽网状内皮组织增生症病毒感染SPF鸡体内的表达水平，120只1日

6、龄SPF鸡随机分为2组，禽网状内皮组织增生症病毒处理组和生理盐水对照组。每个处理组分别在感染后7、14、2l、28、35、42和49d随机取6只鸡处死，迅速取脾脏、胸腺和法氏囊样品用于RNA提取。应用已建立的SYBRGreen1染料实时荧光定量RT-PCR方法，比较处理组和对照组ChlL．6和ChlFN-q,基因mRNA相对表达量的变化。结果显示，与对照组相比，处理组脾脏、胸腺和法氏囊中IL一6和IFN-2'的分泌水平在所有时间点均显著升高(P

7、机理打下了一定基础。关键词：SPF鸡；禽网状内皮组织增生症病毒；白细胞介素6；白细胞介素18；Y干扰素；实时荧光定量RT-PCR。2山东农业大学硕士学位论文QuantitativedetectionofIL一6、IL一18andIFN-YinSPFchickeninfectedwithREVensinlecteAbstractInterleukin．6，alsoknownasBcellstimulatingfactorisanecessaryfactorforinductionofBcellstoproduceantibodies，t

8、helevelofitssecretionmayreflecthumoralimmunefunction．Interleukin一18，alsoknownasIFN-丫induciblefactor,isakindofm