高分辨率熔解曲线（hrm）技术在动物病毒基因分型中的研究及应用

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1、分类号：单位代码：密级学号：博士学位论文高分辨率熔解曲线（技术在动物病毒基因分型中的研究及应用研究生嘎利兵嘆指导教师丁双阳研究员合作指导教师郭鹏举研究员申请学位门类级别农学博士专业名称基础兽医学研究方向兽医药理学与毒理学所在学院动物医学院Ph.D.DissertationResearchandapplicationofhighresolutionmeltingcurveanalysisinthegenotypinganddetectionofanimalvirusesPhDCandidate:GaliBinggaSupervisor:ProfessorDingShuangyangSup

2、ervisor:ProfessorGuopengjuMajor:BasicVeterinaryMedicineResearchField:VeterinaryPharmacologyandToxicologyCollege:CollegeofveterinarymedicineChinaAgriculturalUniversityMay,2015本研究受国家国际科技合作专项“重要动物病原快速检测技术的引进和创新利用”项目资助独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表

3、或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名丨奇年为：少时关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守雌议）学位论文作者签名：命导师签名：

4、时间：年月曰目录搬插图与附表清单綱第一章前言与综述熔解曲线分析方法发展概况技术常用的仪器和荧光染料分析方法国内外研究现状研究目的及意义研究内容与方法第二章方法在动物病毒基因分型中的研究和应用犬细小病毒（检测方法的建立与应用弓丨胃材料与方法结果与分析讨论番鸭和鹅细小病毒（，检测方法的建立与应用引言材料与方法结果与分析第三章方法在动物病毒基因分型中的研究和应用猪瘟野毒株与疫苗毒株鉴别方法的建立与应用引言材料与方法结果与分析讨论猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（方法的建立与应用弓丨材料与方法3.2.3结果与分析職、第四章方法在动物逆转录病毒基因分型中的研究和应用禽白血病病毒检测方法的建立与应用引言

5、材料与方法结果与分析候第五章方法在动物病毒基因分型检测中的条件优化弓丨胃材料与方法结果与分析讨论第六章全文结论第七章创新点参考文献隱親作者简介摘要高分辨率培解曲线（，分析技术作为种新的分子诊断方法在人医医学领域应用较广泛，而在兽医分子诊断领域，尤其在动物病毒基因分型与检测方面国内外研究较少。因此，本研究目的是比较不同分析方法在动物病毒基因分型中的特点，建立常见重要动物疫病快速诊断方法，为该项技术在兽医临床上的应用提供参考依据。本研究选取三种病毒如，犬细小病毒，、番鸭和鶴细小病毒，；两种病毒，猪痕病毒（和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（和一种逆转录病毒，禽白血病病毒（，作为研究对象，并针对各

6、类型病毒特点釆取不同的分析方法。为了区分不同基因型，在基因氨基酸位点和第氨基酸位点分别设计引物和引物，建立了区分不同基因型的分析方法，并从份临床样品中成功检测出份、份、份样品和份混合感染样品（根据和基因序列差异设计出一对简并引物，建立了区分和的分析方法。从份临床样品中检测出份阳性样品（、份阳性样品（、份基因重组样品和份混合感染样品；根据猪瘟野毒株与疫苗毒株’区个碱基的差异，设计出一对特异性引物进行分析。临床样品检测结果表明份临床样品均为野毒株，未检测到疫苗毒株，并建立了以野毒株临床样品值（作为区分野毒株和疫苗毒株判别标准的分析方法；利用序列差异建立了区分和的方法。从份临床样品中共检测出

7、份阳性样品（探针峰为±°，份阳性样品（探针峰为士°。并根据疫苗毒株特异位点，从份阳性样品中鉴定出份疑似疫苗毒株样品；根据禽白血病病毒基因序列筛选出一对亚型特异引物和一对亚型通用弓物，利用片段扩增方法建立了区分禽白血病病毒不同亚型方法，并从临床样品中鉴定出份亚型和份亚型样品。由于亚型（位点）病毒在长期进化过程中已整合进鸡的基因组，亚型（位点）具有独有的熔解曲线特点，容易从其它外源型病毒中区分出来。因此，该方法可用于禽白血病净化工作中。本研究建立了