蛋白磷酸酶2a调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士专业学位论文论文提交日期_____2015年4月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明s所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属

2、苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在_____年__月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：日期:斗Mu’s导师签名：5^破期：蛋白磷酸酶2A调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究中文摘

3、要蛋白磷酸酶2A调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究中文摘要背景：缺血性心脏病（IHD）是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害，其病理改变是缺血区心肌细胞因缺血缺氧而坏死，梗死区逐渐被纤维疤痕所替代，残余心肌则代偿性肥厚，发生心室重构，而心室重构正是造成心梗患者顽固性心力衰竭和死亡的主要原因，虽然药物及介入等治疗手段发展日新月异，但目前仍无法从根本上逆转心室重构及后续的心力衰竭。骨髓间充质干细胞（BMSCs）可促使心肌细胞分裂及再生，修复病变的心肌组织，并维持心脏的自稳态，改善心脏功能，BMSC

4、s移植已作为治疗心衰的一种手段。近年来大量研究发现：BMSCs在心肌组织修复过程中存在迁移。反应性BMSCs是如何迁移到病变心肌组织的，目前已有大量研究表明趋化因子及蛋白磷酸激酶参与BMSCs的迁移，而蛋白磷酸酶对BMSCs的迁移作用方面的研究报道尚少。目的：研究蛋白磷酸酶2A（PP2A）对本底水平及SDF-1/CXCR4轴介导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）迁移的调控；探寻SDF-1/CXCR4轴介导的BMSCs迁移过程中可能发挥作用的PP2A功能性调节亚基。方法：本实验以体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）为

5、研究模型，采用PP2A的特异性抑制剂，并结合脂质体转染技术导入siRNA，从不同的角度调节PP2A的活性，并采用划痕实验和Transwell迁移小室实验评价PP2A对BMSCs迁移的调控作用。（1）划痕实验（wound-healing）：分别用12孔板培养不同处理的各组细胞，每孔接种细胞数控制为1.0×105/ml，进行划痕实验，在显微镜下观察划痕修复的过程，比较不同处理组细胞水平运动能力的差异。（2）Transwell小室体外迁移实验：取生长状态良好的BMSCs细胞培养48h后，消化并收获细胞，用无血清DMEM低糖培养基洗

6、3次，分别接种2.0×105个细胞于已行各组处理因素浸润的Transwell小室中（滤膜微孔直径8μm），行迁移实验。迁移4h后剪下滤膜，用DAPI荧光染液染色，在20倍荧光显微镜下，每孔计数5个视野的细胞数，并取平均值，比较不I中文摘要蛋白磷酸酶2A调控骨髓间充质干细胞迁移的实验研究同处理因素下BMSCs垂直运动能力的差异。取生长状态良好的BMSCs分别进行脂质体转染siNC和siPPP2Ca，前者为对照组，后者沉默PP2A催化亚基PPP2Ca，采用Transwell小室迁移实验，通过与对照组的比较，评价沉默PPP2Ca后

7、BMSCs迁移能力的变化。通过实时定量PCR检测SDF-1刺激后PP2A主要调节亚基的表达变化，探寻SDF-1介导BMSCs迁移过程中可能起作用的功能性调节亚基。结果：（1）Transwell小室迁移实验中，10nM、25nM、50nM三个OA梯度浓度组迁移细胞数均减少，较对照组有统计学差异（p<0.05）；BMSCs迁移能力与OA浓度呈负相关，OA10nM组与OA25nM组迁移到滤膜上的细胞数的差异无统计学意义（p>0.05），OA50nM组与OA10nM组和OA25nM组均有差异（p<0.05）。SDF-1与OA共刺激组

8、BMSCs的迁移能力较单SDF-1刺激组明显降低（p<0.05）（2）划痕实验中，本底水平BMSCs迁移的距离比较，OA作用下BMSCs的划痕愈合距离明显小于对照组，12h时间点OA组与对照组无统计学差异（p>0.05），24h、48h时间点较对照组均有差异（p<0.05）。验证SDF-1