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1、学校代码：10270分类号：Q3学号：152200866硕士学位论文三分三WRKY转录因子AaWRKY23的克隆及功能初探学院：生命与环境科学学院专业：遗传学研究方向：药用植物基因工程研究生姓名：赵维维指导教师：开国银教授完成日期：2018年5月ADissertationSubmittedToShanghaiNormalUniversityForTheMaster’sDegreeCloningandpreliminaryinquiryofaWRKYtranscriptionfactorAaWRKY23inA
2、nisodusacutangulusCandidate:WeiweiZhaoSupervisor:ProfessorGuoyinKaiSpecialty:GeneticsDepartment:CollegeofLifeandEnvironmentScienceShanghaiNormalUniversityMay2018上海师范大学硕士学位论文摘要摘要三分三（Anisodusacutangulus）是我国云南特有的茄科山莨菪属的多年生草本植物，由于能够产生托品烷生物碱而被广泛关注。三分三中生物碱的总含量达到
3、1.2%，比世界上其它一些茄科植物如天仙子（Hyoscyamusniger），颠茄（Atropabelladonna），曼陀罗（DaturaStramonium）等中的含量都要高的多，是开发和利用生物碱的不可多得的一种植物资源，因此作为药用植物它具有重要的研究意义和应用价值。托品烷类生物碱是一类来自茄科植物的次生代谢产物主要包括莨菪碱（Hyoscyamine）、山莨菪碱（Anisodamine）、樟柳碱（Anisodine）和东莨菪碱（Scopolamine）。它是一类具有巨大药用价值的抗胆碱药物，主要作用
4、于副交感神经系统，具有镇痛、止咳、麻醉，抗晕动症等作用，其中莨菪碱和东莨菪碱被广泛应用于临床治疗，市场需求十分巨大。因此利用基因工程手段提高三分三中莨菪碱和东莨菪碱的产量，将有效缓解市场紧张的供求矛盾。本论文以三分三为材料，运用分子生物学手段，首次从三分三中克隆了一条WRKY转录因子AaWRKY23。分析了该转录因子的生物学特性，通过外植体的遗传转化获得了其过表达的毛状根株系，并研究了其在生物碱合成途径中的功能，这些为通过代谢工程获得高产托品烷生物碱毛状根株系提供了基础。现阶段取得的研究结果如下：（1）根据
5、三分三转录组数据库注释，获得80条AaWRKY基因，经去除重复序列和WRKY结构域不完整的序列后，得到了33条AaWRKY基因（AaWRKY1-33）。（2）托品烷生物碱合成途径中关键酶基因的组织表达谱结果显示：AaPMT1,AaPMT2,AaTRI,AaCYP80F1,AaH6H都在根中高表达。（3）33个AaWRKY基因的组织表达谱结果显示AaWRKY1,2,4,5,7,8,9,11,12,13,14,15,17,19,21,23,25,27,28,29,30,31,32这23个AaWRKY基因在根中高
6、表达。而TAs合成途径中的五个关键酶基因也都是在根中高表达的，表明这些WRKY转录因子与这些关键酶基因在表达模式上具有一致性。所以猜测这些基因可能参与三分三中托品烷生物碱的合成调控。（4）将这23个在根中高表达的AaWRKYs与拟南芥中的AtWRKYs，烟草中的NtWRKYs，以及目前已经证实参与植物次生代谢调控的一些WRKY转录因子进行了系统进化树分析，结果显示AaWRKY23与CrWRKY1，OpWRKY1，AtWRKY70，AtWRKY54，SmWRKY70、54这些基因聚集在一起，而且CrWRKY1
7、I上海师范大学硕士学位论文摘要已被报道参与植物的次生代谢调控，因此猜测该基因可能参与三分三中TAs的合成调控，所以选择该基因进行后续研究。（5）克隆获得WRKY转录因子AaWRKY23，并对该转录因子进行了生物信息学分析，确定该WRKY转录因子与番茄中的SlWRKY70相似度最高。亚细胞定位结果显示AaWRKY23定位在细胞核中。（6）通过C58C1介导的三分三外植体的遗传转化，获得了AaWRKY23的过表达转基因毛状根，qRT-PCR分析显示AaPMT1,AaPMT2,AaTRI,AaCYP80F1,Aa
8、H6H这些关键酶基因在过表达株系中表达水平均有不同程度的上调。HPLC检测结果显示，对照组中总生物碱的平均含量为1.946mg/gDW,过表达株系中总生物碱的平均含量为2.901mg/gDW，说明过表达AaWRKY23对总托品烷生物碱的积累有促进作用。（7）酵母单杂实验结果显示AaWRKY23转录因子能够与AaH6H启动子中的W-box结合，从而调控AaH6H基因的表达。（8）双荧光素酶（Dual-Lucifer
