绵羊nos基因的克隆及其在布鲁氏菌侵染过程中的作用

《绵羊nos基因的克隆及其在布鲁氏菌侵染过程中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、SheepNOSgenecloneanditsfunctionofBrucellainfectionADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByLiJian-hua(Biochemistryandmolecularbiology)DissertationSupervisor:Prof.GaoJian-fengJune,2015摘要目的：本研究通过对中国美利奴羊eNOS基因编码区SNP位点利用SSCP的方法进行检测

2、，并对有多态性位点的外显子进行克隆，找出与布病易感性相关的SNP位点。用布鲁氏菌M5侵染小鼠后对小鼠eNOS基因的浓度、酶活力进行测定并对肝、脾组织中eNOS基因表达量进行检测，探讨了中国美利奴羊eNOS基因与布鲁氏菌病易感性相关性及布鲁氏菌侵染过程中eNOS的作用，为选育绵羊抗病新品种及布病预防寻求新途径提供一定依据和理论支持。方法：1、将人、绵羊eNOS基因mRNA序列（登录号：NM_000603.4、NM_001129901.1）利用BLAST比对分析找出人、绵羊eNOS基因的外显子序列，再通过GenBank中的SNP数据库查找人和绵羊的SNP位点。利用DNAMAN6.0软件对

3、人eNOS基因外显子上的SNP位点进行分析，获得多态性较为丰富的人eNOS基因外显子序列，再利用GeneDoc软件比对找出与这些外显子相似性较高的绵羊eNOS基因外显子序列。2、本实验利用布鲁氏菌虎红平板凝集诊断试剂盒对162只中国美利奴羊血液样本进行布鲁氏菌血清检测，然后利用PCR-SSCP方法对eNOS基因外显子的SNP位点进行检测，后对含有SNP位点的外显子进行克隆测序。通过SHEsis在线分析软件对检测出的SNP位点进行布病易感性分析。3、用布鲁氏菌M5侵染小鼠，分别在侵染后第0、3、7、14、28天检测小鼠eNOS的含量和活力，将测得的数据导入EXCEL中，利用SPSS17

4、.0对侵染组和对照组的含量和活力进行统计分析。-△△Ct4、用荧光实时定量PCR技术对侵染第28天小鼠和对照组小鼠eNOS基因进行扩增，通过2法分析和修正数据，最后将所得结果导入EXCEL中，得到肝、脾组织相对表达量，对生成的各个样本的相对表达量采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。结果：1、通过生物信息学分析，找到与人同源性高的中国美利奴羊eNOS基因的10个外显子，这10个外显子分别是exon2、exon7、exon8、exon13、exon14、exon16、exon17、exon18、exon19、exon20而在人的这10个外显子中多态性较为丰富。2、对162只中国美

5、利奴羊进行虎红平板检测，共检测发现阴性101只，阳性个体为61只，并对出现的阳性样本进行复检，布鲁氏菌检出率为37.65%。利用PCR-SSCP的方法对这162只中国美利奴羊eNOS基因10个外显子进行检测，发现中国美利奴羊eNOS基因exon8序列第142位发生了碱基突变，由G变为A，氨基酸由Ala变为Thr，该突变位点也是一个新的突变位点（ss974768653：A142G）。利用SHEsis在线统计分析软件和SPSS17.0统计分析软件，结果表明该多态性位点的基因型及等位基因频率分布均符合Hardy-Weiberg平衡定律（P>0.05），具有群体代表性，但该位点的基因型及等位

6、基因频率分别在侵染组和对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。3、用布鲁氏菌M5侵染小鼠后，发现在侵染后第14天出现了肝、脾肿大。在第0、3、7、14、28天分别测定侵染组和对照组eNOS含量和活力，通过统计分析发现侵染组和对照组eNOS含量没有发生变化，而eNOS活力在侵染后的第14天开始升高。I4、利用实时荧光定量对侵染第28天和对照组中小鼠肝、脾eNOS基因进行表达分析发现侵染组中肝和对照组中肝的相对表达量差异不显著,P值为0.685（P>0.05）；在侵染组和对照组中脾的相对表达量差异不显著，P值为0.512（P>0.05）。结论：1、经过PCR-SSCP方法对中国美利

7、奴羊eNOS基因的10个外显子进行多态性分析，最终在exon8上发现1个多态性位点，但是该多态性位点与绵羊布病易感性无关。2、对侵染后的小鼠eNOS含量和活力进行检测后发现，eNOS含量在侵染后没有发生明显变化，而eNOS活力在侵染后第14天出现升高，说明布鲁氏菌侵染小鼠后，并没有引起eNOS含量的变化，而在第14天以后引起eNOS活力升高，这一过程也可能导致NO释放量升高。3、利用实时荧光定量PCR对侵染组和对照组小鼠肝、脾进行相对表达量分析后发现侵染组