甘露聚糖修饰布鲁菌多肽靶向树突细胞增强免疫机制研究

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1、參甘露聚糖修饰布鲁菌多肤祀向树突细胞增强免疫机制研究ＥｎｈａｎｃｅＩｍｍｕｎｉｔｙｍｅｃｈａｎｉｓｍｂｙＭａｎｎｏｓｙｌａｔｅｄＢｒｕｃｅｌｌａＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅＴａｒｇｅｔｉｎＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｇ作者姓名：佟春玉专业名称：预防兽医学研究方向：病原微生物与分子免疫学指导教师：韩文瑜教授学位类别；农学博±培养单位：动物医学学院论文答辩日期：２０１５年１２月４日授予学位日期；年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称

2、工作单位姓名职称Ｘ作单位盲审专家正高级中国化业大学主席李祥瑞教授南京农业乂学盲审专家正高级中国农地科学院委员高学军教授东北农业大学官审专家正高级四川农业大学邓旭明教授吉林火学盲审专家正高级浙江义学Ｔ壮教授吉林人学盲审专家卸ｊ罔级巧北农林科技火学雷连成教授吉林大学刘国文教授吉林大学．贺文巧教授吉林乂学本研究由以下项目资助国家863计划畜禽重要细菌基因工程疫苗的研究和开发（项目编号：2011AA10A210）未经本论文作者的书面擇权，依法收存和保管本论

3、文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学博：ｔ学位论文原创性声明：本人郑重声明所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，。独立进行研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式标明。本

4、人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名；传义日期：年２月／日／＞１＾中文摘要甘露聚糖修饰布鲁菌多肽靶向树突细胞增强免疫机制研究布鲁菌病（Brucellosis，布病）是由布鲁菌（Brucella）引起的一种人畜共患传染病，严重影响人和动物公共卫生，疫苗防治布鲁菌病是控制该病的最有效策略之一。布鲁菌是典型的胞内寄生菌，能感染巨噬细胞并使之丧失抗原提呈能力。树突细胞（DC）抗原提呈能力最强，且是唯一能够诱导细胞免疫的专职抗原提呈细胞。甘露糖受体（MR）被证明在未成熟DC

5、表面表达，其具有酪氨酸序列，能够在早期内吞小体中进行快速循环。MR的糖识别区（CRDs）有8个，每个结合区能够结合一个糖分子。目前研究表明能与甘露糖受体结合的配体有甘露聚糖、岩藻糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、β-1，3-葡聚糖，乙酰半乳糖胺。由于甘露聚糖在机体内有靶向DC的能力，使得二者在防治布鲁菌感染方面表现出极大的应用潜力。本研究拟以DC及其靶向剂甘露聚糖作为研究对象，探索甘露聚糖作为布鲁菌多肽靶向树突细胞载体预防布鲁菌病的潜力及其诱导树突细胞分化成熟作用的分子机制。筛选靶向DC甘露糖受体的多

6、糖。实验采用体外诱导小鼠骨髓来源树突细胞（BMDCs），与FITC荧光标记的甘露糖共孵育后分别加入D-半乳糖，D-甘露糖，L-岩藻糖，D-葡萄糖。通过荧光显微镜定性检测，流式细胞仪荧光定量检测。依据竞争性抑制原理判定与BMDCsMR亲和力最强的单糖是D-甘露糖。重复此法比较甘露糖和不同浓度的甘露聚糖与BMDCsMR亲和力差异。结果显示甘露聚糖对BMDCsMR的亲和力显著高于D-甘露糖，且有浓度依赖性。甘露聚糖衍生物作为载体增强布鲁菌多肽免疫效应分析。甘露聚糖被不同浓度高碘酸钠氧化，盐酸羟胺-电位滴

7、定法测定氧化甘露聚糖上的醛基浓度。合27（第48到第74氨基酸）多肽，另合成富含可糖基修饰的ε-NH成布鲁菌Omp312的赖氨酸尾部（5个KG重复）Omp3137。小鼠免疫评价两种多肽、不同反应条件、甘露糖和不同甘露聚糖衍生物修饰的糖肽复合物免疫效果。实验证明在Omp3127肽抗原尾部增加赖氨酸修饰位点的Omp3137不改变多肽免疫效果。甘露聚糖修饰Omp3137与氰基硼氢化钠端位催化甘露聚糖修饰Omp3127具有一致的免疫结果，并可以避免反应中应用毒性较高的氰化物。甘露聚糖修饰的Omp3137免

8、疫效果优于甘露糖修饰的Omp3137；氧化型甘露聚糖（OM）修饰IOmp3137能够同时引起细胞免疫和体液免疫，且提高细胞免疫尤为显著；还原型甘露聚糖（RM）修饰Omp3137显著提高体液免疫，但提高细胞免疫不显著。甘露聚糖衍生物作为免疫激活剂的验证。小鼠体内注射OM和RM，流式细胞仪检测脾DCs的CD40、CD80和CD86表达量。OM和RM分别刺激小鼠骨髓来源树突细胞（BMDCs）；流式细胞仪检测BMDCs表面成熟标志因子CD40、CD80和CD86表达量；RT-PCR检测IL