hbv去甘露聚糖修饰逃逸树突状细胞dc-sign免疫识别的研究

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1、华中科技大学博士学位论文HBV去甘露聚糖修饰逃逸树突状细胞DC-SIGN免疫识别的研究华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科博士研究生邹小静指导教师田德英教授中文摘要目的：研究HBV感染是否会引起宿主细胞GolgiMⅠ活性升高，通过抑制GolgiMⅠ介导的HBV去甘露聚糖修饰，观察对DC-SIGN识别及DC成熟和功能的影响，来阐明DC-SIGN在HBV感染中介导的作用，并初步探讨HBV通过去甘露聚糖修饰逃逸DC-SIGN的识别，限制DC的活化的机制。方法：一.研究HBV感染是否会引起宿主细胞GolgiMⅠ活性升高1.培养HepG2细胞和HepG2.2.15细

2、胞，采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化高尔基复合体；2.比色法检测两种细胞高尔基复合体中GolgiMⅠ的活性；3.RT-PCR法检测基因MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1mRNA的表达；4.Westernblot检测上述3种基因编码的蛋白的表达情况。二.DC-SIGN在识别HBV并活化DC中介导作用的研究1.将不同终浓度的GolgiMⅠ抑制剂——基夫碱加到HepG2.2.15细胞的培养基中，作用24小时后分离高尔基体，比色法检测GolgiMⅠ的活性；2.在HepG2.2.15细胞的培养基中加入终浓度为5ug/ml的基夫碱，持续处理5天后收集其培养上清液，提取

3、得到高甘露糖型HBV颗粒，采用荧光定量PCR的方法检测HBVDNA滴度；1华中科技大学博士学位论文3.分离健康人外周血单个核细胞，在体外GM-CSF和IL-4的作用下诱导分化成DC，光学显微镜和透射电镜观察细胞的形态特征；64.将前面得到的高甘露糖型HBV颗粒（5×10copies/ml），加入到培养至第5天的DC的培养基中，培养至第7天时，采用透射电镜观察细胞的形态结构，流式细胞仪检测DC表面CDla、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子的表达，MTT法检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力，ELISA法检测DC上清液中IL-12的水平。同时设加PBS组和

4、加未经基夫碱处理的HepG2.2.15细胞分泌的HBV组作为对照。5.将培养至第5天的DC预先经DC-SIGN特异性抗体阻断2小时，而后再分别加入PBS和上述两种类型的HBV干预，检测指标同前。三.HBV去甘露聚糖修饰逃逸DC-SIGN免疫识别的机制初探1.采用分子克隆的方法构建HBVS、LS、MS、HBe、HBc、HBx6个功能蛋白的真核表达载体，采用酶切及DNA测序的方法鉴定重组质粒；2.再将以上构建的6个质粒和pEGFP-N1质粒分别经Lipofectamine2000转染入HepG2细胞中，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，计算转染效率，比色法检测细

5、胞高尔基体内GolgiMⅠ的活性；3.分别将pEGFP-N1-HBe质粒和pEGFP-N1质粒转染HepG2细胞，RT-PCR检测转染细胞GolgiMⅠ3种亚型的基因MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1mRNA的表达情况，Westernblot检测相应的蛋白表达。结果：一.研究HBV感染是否会引起宿主细胞GolgiMⅠ活性升高与HepG2细胞相比，HepG2.2.15细胞GolgiMⅠ的活性明显升高，MAN1A1、MAN1A2的mRNA水平显著上调，所编码的MAN1A1、MAN1A2蛋白量也显著增加，而MAN1C1的mRNA和蛋白的表达量无明显变化。二.D

6、C-SIGN在识别HBV并活化DC中介导作用的研究1.基夫碱在HepG2.2.15细胞中可发挥对GolgiMⅠ的抑制作用，5ug/ml是合适的干预浓度；2华中科技大学博士学位论文2.基夫碱干预的HepG2.2.15细胞与未经基夫碱干预的HepG2.2.15细胞分泌的HBV载量无显著差异；3.电镜观察培养第7天的经TNF-α刺激的DC，细胞体积变大，突起明显增多，向四周伸展出大量的毛刺样细胞质突起，长短不一，呈现典型成熟DC的形态；4.与HBV组相比，基夫碱+HBV组的DC表面CDla、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子的表达增加，分泌IL-12的水

7、平升高，刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力亦明显增强；5.预先加入DC-SIGN特异性抗体进行阻断的DC，在经高甘露糖型HBV干预后，与未经抗体阻断组的DC相比，DC表达CDla、CD80、CD83、CD86、HLA-DR分子的量下降，分泌IL-12的量减少，刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力亦有所减弱。三.HBV去甘露聚糖修饰逃逸DC-SIGN免疫识别的机制初探1.构建的6个质粒酶切及测序的结果均与预计结果一致；2.转染各个质粒的细胞在荧光显微镜下都可见到绿色荧光的表达；3.与转染pEGFP-N1-S、pEGFP-N1-LS、pEGFP-N1-MS、pEGFP-N1

8、-HBc、pEGFP-N1-HBx质粒