猪zfx基因干扰载体筛选及性控效果的验证

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1、分类号：密级：学号：2012108003单位代码：10759石河子大学硕士学位论文猪Zfx基因干扰载体筛选及性控效果的验证TheRNAivecterscreeningandverificationoftheeffectsofsexualcontrolfromSwineZfxgene学位申请人宁孟影指导教师贾斌教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月TheRNAivecterscreeningandverification

2、oftheeffectsofsexualcontrolfromSwineZfxgeneADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByNINGMengYing(AnimalGenetics,BreedingandReproductionScience)DissertationSupervisor:Prof.JiaBinJune,2015本研究由以下项目资助：“兵团

3、博士资金专项”（项目编号：2012BB016）“Doctor’sSpecialFundofXinjiangProductionandConstructionCorps”(projectnumber:2012BB016)摘要雄性哺乳动物的睾丸是生成精子和分泌雄性激素的场所。Zfx（Zincfinger-X，Zfx）是锌脂蛋白家族成员，位于X染色体短壁上的性别决定区（TDF）内。Zfx可以作为一个较强的转录激活因子，从而引导靶基因通过核膜定位在X精子的细胞核内，可能对某些基因在X精子发生过程中具有转录激活作用，与X精子的形成发生

4、有关。本研究根据Zfx基因mRNA序列特点，设计shRNA片段，构建重组慢病毒骨架载体，然后进行体外细胞水平RNAi试验，qPCR分析后，筛选出对Zfx基因mRNA表达水平抑制率较高的重组载体，最后通过睾丸注射法注射给公猪，自然交配后，统计后代的性别比例，从而研究干扰Zfx基因后对猪性别控制的影响。具体研究结果如下：1、猪Zfx基因的克隆根据鼠和牛Zfx基因分段设计4对具有重叠区域的引物，采用普通PCR的方法克隆猪Zfx基因，之后用DNAMAN进行拼接，得到的猪Zfx基因序列长度为2154bp，提交到NCBI上的登录号为KF

5、803247。2、重组慢病毒质粒干扰载体的构建根据克隆得到的猪Zfx基因mRNA序列，然后根据RNA干扰设计原则，设计并合成4对shRNA干扰片段。再以慢病毒骨架质粒pLentiLox3.7（pLL3.7）作为载体，构建了4个靶向Zfx基因的shRNA表达载体(pLL3.7/d、pLL3.7/e、pLL3.7/f、pLL3.7/g)。经过测序验证所构建的4个重组表达载体中干扰片段的序列及插入位置均正确，并且调控元件完整。说明这4个shRNA重组表达载体构建成功，可以用于猪Zfx基因的体外干扰试验。3、将构建好的重组表达载体进

6、行猪体外RNAi试验养殖场采回27-32日龄的仔猪睾丸，应用两步酶消化法分离出生精细胞，进行体外共培养。通过高效转染试剂盒（HET）将构建好的4个shRNA重组表达载体分别转染生精细胞。待36-48小时后提取细胞总RNA，利用qPCR检测mRNA的表达水平。初步在细胞水平上筛选出3个干扰效果较好的shRNA重组表达载体pLL3.7/d、pLL3.7/e、pLL3.7/f，Zfx基因的mRNA表达量分别为55%、56%、44%，与对照组相比均差异显著（P<0.05）。4、将筛选的重组表达载体进行猪体内RNAi试验选取健康公猪6

7、头，随机分为3组，每组各2头，将用含双抗的PBS稀释的质粒pLL3.7/d、pLL3.7/e、pLL3.7/f分别注射到3组公猪睾丸内，每头3mg（1.5mg/侧），每隔9天注射一次，共注射3次，质粒pLL3.7/d在三次注射完后进行配种，而质粒pLL3.7/e和pLL3.7/f每次注射完后配种。结果显示：注射质粒pLL3.7/d组的雄性仔猪比例为69.9%，与正常的1:1性别比例相比均差异显著；分别注射质粒pLL3.7/e和pLL3.7/f的试验组，三个时间点每次配种所得的后代仔猪性别比例均差异不显著，但三个配种时间所产后

8、代总计，pLL3.7/e的仔猪性别差异显著(P＜0.05)，总雄性仔猪比例为59%；pLL3.7/f差异不显著(P＞0.05)，雄性仔猪比例分别为49%。实验说明对Zfx基因进行干扰可以影响X精子的受精能力。关键词：Zfx基因；猪；RNAi；生精细胞；性别控制IAbstractTestis