烟酰胺磷酸核糖转移酶（nampt）在大鼠骨髓间充质干细胞复制性衰老中的表达及意义

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1、烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）在大鼠骨髓间充质干细胞复制性衰老中的表达及意义TheExpressionofNamptinReplicativeSenescenceofRatBoneMarrowMesenchymalStemCellsanditsSignificance作者姓名：林琳专业名称：病理学与病理生理学指导教师：何旭教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月21日前言未来的2040年将成为中国人口老龄化的高峰阶段，中国已经开始步入“老龄社会”。老龄化人口的增多将导致劳动力短缺，进而抑制经济的增长。

2、衰老本身是一个导致多种疾病高发的危险因素，如阿尔茨海默病、肿瘤及II型糖尿病等，将严重影响个体的生活和发展。因此明确衰老和长寿的机制，开发有效的抗衰老方法不仅是生命科学领域的重大问题，也是重要的社会问题。生物体衰老的本质是细胞衰老。干细胞作为一类细胞，尽管具有高度的自我更新能力及多向分化潜能，但最新研究显示，干细胞与体细胞一样，并非是“长生不老”的，也会出现衰老。衰老的干细胞不仅表现出形态学变化，而且其功能也会发生不同程度的下降，从而导致生物体衰老及各种老龄化疾病的发生。间充质干细胞（mesenchymalste

3、mcells,MSCs）因具有自我更新、多向分化潜能以及无伦理和移植免疫排斥问题，现已成为组织工程学种子细胞的主要来源。然而，由于MSCs必须要经过体外传代培养及大规模扩增后才能满足应用及研究的需要，因而这种复制性衰老的存在既严重阻碍了MSCs在组织、器官修复及临床疾病治疗中的应用，又满足不了组织工程的基础研究和未来的产业化研究中大+量种子细胞的需求。这是干细胞研究领域中重大的科学问题。最近提出的以NAD为中心的哺乳动物衰老理论认为，烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamidephosphoribosyltra

4、nsferase,Nampt）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide-adenine++dinucleotide,NAD）生物合成的限速酶，决定代谢中NAD水平；而抗衰老蛋白+Sirt1活性依赖于NAD，受Nampt调节。该理论的提出使我们推测：Nampt可能对MSCs衰老具有调控作用。本研究通过体外连续传代培养法建立大鼠BMSCs（rBMSCs）复制性衰老模型，在对模型进行系统评估后，探讨Nampt在rBMSCs复制性衰老中的表达及意义，为阐明干细胞衰老机制及延缓干细胞衰老提供重要的理论和实验基础。I

5、中文摘要烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）在大鼠骨髓间充质干细胞复制性衰老中的表达及意义间充质干细胞（MSCs）体外复制性衰老将造成组织工程的基础研究和未来的产业化研究中种子细胞的不足，严重影响其在组织、器官再生和修复中的应用，+这是干细胞研究领域中重大的科学问题。随着以NAD为中心的哺乳动物衰老理论的提出，烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）逐渐成为人们研究的焦点。Nampt++是NAD生物合成的关键限速酶，决定代谢中NAD水平，而某些抗衰老蛋白的+活性，如沉默信息调控因子Sirtuins，则严格受控于NAD浓度

6、。以往关于Nampt与细胞衰老关系的研究多集中于体细胞。Nampt可能是一种延缓人类体细胞衰老的因子。结合我们前期实验，体外连续传代培养使MSCs生长减慢；衰老个体MSCs中Nampt表达降低。我们推测，在干细胞衰老过程中，Nampt可能发挥调控作用。本研究以大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）为研究对象，利用体外连续传代培养法建立rBMSCs复制性衰老模型，并通过观察细胞形态学变化，分析细胞周期，检测衰老相关-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性及衰老相关因子表达等，对模型进行系统评估；应用qRT-PCR、We

7、sternblot和细胞免疫荧光，检测Nampt在rBMSCs复制性衰老模型中的表达。所得结果如下：1.成功从大鼠骨髓中分离培养出rBMSCs，rBMSCs表达间充质干细胞标记物CD44、CD90和CD105，而不表达内皮标记物CD31和白细胞标记物CD45，并具有成骨、成脂分化潜能。2.成功建立rBMSCs体外复制性衰老模型。随着传代培养次数的增加，rBMSCs形态出现“衰老样”的改变，细胞长宽比减小，细胞面积增大；细胞生长增殖速度减慢，细胞群体倍增时间延长；细胞周期发生阻滞，G0/G1期细胞增多，而S期细胞减

8、少；rBMSCs成骨和成脂能力降低；衰老相关SA-β-gal活性增INK4a强；衰老相关因子p16表达增加。II3.Nampt表达于rBMSCs；在rBMSCs体外复制性衰老模型中，随着传代培养时间的延长，无论在mRNA水平上，还是在蛋白水平上，Nampt表达均逐渐降低，呈时间依赖性。综上所述，Nampt在rBMSCs体外复制性衰老过程中表达下调，Nampt可能对rBMS